[发明专利]模板的表面连环化

权利要求书

1.制备用于核酸测序反应的固定化模板的方法，所述方法包括：

(a)提供固体支持物，所述固体支持物具有在其上固定化的正向和反向扩增引物；

(b)提供靶核酸，其中所述靶核酸包含：

(i)与所述正向扩增引物互补的已知序列的第一区域；

(ii)第一模板区；

(iii)与所述反向扩增引物基本上相同的已知序列的第二区域，其中所述第一模板区在所述已知序列的第一区域和所述已知序列的第二区域之间；和

(iv)与所述正向扩增引物互补的已知序列的第三区域，其中所述第一模板区和所述已知序列的第二区域在所述已知序列的第一区域和所述已知序列的第三区域之间；

(c)在适合于杂交的条件下将所述靶核酸应用于所述固体支持物，从而所述已知序列的第一区域与所述正向扩增引物杂交；

(d)延伸杂交的正向扩增引物以产生包含所述靶核酸的互补拷贝的第一固定化模板；

(e)使来自所述第一固定化模板的所述靶核酸变性；

(f)使所述第一固定化模板与所述反向扩增引物杂交，从而第二已知序列区域的互补拷贝与所述反向扩增引物杂交；并且

(g)延伸杂交的反向扩增引物以产生第二固定化链，所述第二固定化链包含位于所述已知序列的第一区域和所述已知序列的第二区域之间的第一模板区域；

(h)使来自所述第一固定化模板的所述第二固定化链变性；

(i)使所述第二固定化链与所述第一固定化模板杂交，从而所述第二固定化链的所述已知序列的第一区域与所述固定化模板中的所述已知序列的第一区域的互补拷贝杂交；

(j)延伸所述已知序列的第一区域的3’OH以产生所述第二固定化链的多联体；并且

(k)延伸所述已知序列的第一区域的互补拷贝的3’OH以产生所述第一固定化模板的多联体。

2.权利要求1的方法，所述方法还包括：

(l)使所述多联体变性并且重复步骤(i)、(j)和(k)以产生每条链的进一步的多联体。

3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述正向扩增引物包含正向互补性区，所述正向互补性区与所述反向扩增引物的反向互补性区具有互补性。

4.权利要求3的方法，其中所述正向互补性区直接位于与所述靶核酸的所述已知序列的第一区域具有互补性的区域的5’；和/或

其中所述反向互补性区直接位于与所述靶核酸的所述已知序列的第二区域具有基本上相同的序列的区域的5’；和/或

其中所述正向互补性区和反向互补性区配置为使得杂交和延伸的重复循环产生所述第一固定化链的多联体，所述多联体中的每个拷贝与接着的拷贝通过来自所述正向互补性区的序列分开；和/或

其中所述正向互补性区和反向互补性区配置为使得杂交和延伸的重复循环产生所述第二固定化链的多联体，所述多联体中的每个拷贝与接着的拷贝通过来自所述反向互补性区的序列分开。

5.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述多联体包含至少2个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。

6.权利要求5的方法，其中所述多联体包含至少3个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。

7.权利要求6的方法，其中所述多联体包含至少4个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。

8.权利要求7的方法，其中所述多联体包含至少5个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。

9.权利要求8的方法，其中所述多联体包含至少6个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。

10.权利要求9的方法，其中所述多联体包含至少7个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。

11.权利要求10的方法，其中所述多联体包含至少8个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。

12.权利要求11的方法，其中所述多联体包含至少9个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。