[发明专利]具有受控铜离子的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及源自生物体的培养基添加剂在制备抗体药物中的用途，并且涉及通过利用关于添加剂的铜含量的信息来稳定抗体药物的质量的方法。

背景技术

在培养动物细胞以获得动物细胞产生的天然蛋白质中或在培养用编码所需蛋白质的基因转染的动物细胞以获得所需蛋白质等中，不仅基础营养素(诸如，盐、糖、氨基酸和维生素)而且源自生物体的培养基添加剂通常被添加到用于增殖动物细胞的特定目的的培养基中，从而充分地防止在培养的早期阶段细胞存活比率上的显著下降以维持培养液中活细胞的数量并使其能够延长培养。此外，从制造成本的角度出发，蛋白质制备的产量优选为尽可能的高，为此，有时进行补料分批培养。

同时，谈及通过基因重组制备的蛋白质(诸如，抗体药物)，理论上它们应该具有从基因序列预测的氨基酸序列，但实际上它们可能包括各种非均一的成分。这是由于已知或新的体内(转录后(翻译))修饰或物理化学(非酶)反应(Harris R J.，J Chromatogr A.1995；705：129-134)。这些反应进程的变化将自然导致蛋白质中非均一组分含量的变化。作为活性药物成分制备的蛋白质中的非均一组分的变化优选为尽可能的小。

在抗体药物中含有的非均一成分中，在重链的C-末端处酰胺化的分子种类是已知的(Tsubaki M et al.，Int J Biol Macromol.2013 Jan；52：139-47；WO2005/090405)。虽然对于处于C-末端的抗体药物的酰胺化反应仍未阐明其反应机理，但已知在用于通过培养动物细胞制备抗体药物的培养基中的铜含量与所制备的抗体药物中C-末端酰胺化种类的量呈正相关(Kaschak T.et al.，mAbs，3：6，577-583，2011)。

然而，完全不清楚的是当将源自生物体的培养基添加剂添加到培养基中并且通过培养制备抗体时，添加剂的制备在批次之间铜含量上的差异如此之大，以至于在制备的抗体中C-末端酰胺化种类副产物的含量由于该批次-批次的差异而不同。

现有技术文献

专利文献

专利文件1：WO2005/090405，标题为“Subtypes of humanized antibody againstinterleukin-6receptor”。

非专利文献

非专利文件1：Harris R J.“Processing of C-terminal lysineand arginine residues of proteins isolated from mammalian cell culture”J Chromatogr A.1995；705：129-134。

非专利文件2：Tsubaki M，Terashima I，Kamata K，Koga A“C-terminal modification of monoclonal antibody drugs：amidated species as a general product-related substance”Int J Biol Macromol.2013 Jan；52：139-47。

非专利文件3：Kaschak T.et al.“Characterization of the basic charge variants of a human IgG1：effect of copper concentration in cell culture media”mAbs，3：6，577-583，2011。

发明内容

技术问题

本发明人首先确定了源自生物体的培养基添加剂的制备涉及批次之间的差异，该批次之间的差异极难控制在有限范围内，并因此导致了在使用该添加剂制备的抗体中C-末端酰胺化种类的质量的变化。由于抗体药物理想地在其非均一性上具有最小的可能变化，本发明人对控制抗体制备中C-末端酰胺化种类的量的变化的方法进行了深入研究。

因此，本发明的目的是提供一种方法以通过在培养基中培养动物细胞来控制制备的蛋白质中C-末端酰胺化种类的量，其中源自生物体的培养基添加剂已添加到所述培养基中。

问题的解决方案

作为解决上述问题的深入研究的结果，本发明人开发了一种新颖的细胞培养方法，其特征在于测量源自生物体的培养基添加剂的各个生产批次的铜含量并且将由所测量的铜含量作为指标而选出的批次适当地添加到培养基中，并且实现了本发明。

本发明总结如下。