[发明专利]用于诱导造血细胞分化的方法和组合物

权利要求书

1.一种用于引导多能干细胞向造血细胞系分化的方法，包含：

(i)使多能干细胞接触包含BMP途径激活剂以及可选的bFGF的第一组合物，以获得中胚层细胞；

(ii)使中胚层细胞接触包含BMP途径激活剂、bFGF和WNT途径激活剂的第二组合物，以获得具有永久造血内皮(HE)潜能的中胚层细胞；以及

(iii)使具有永久HE潜能的中胚层细胞接触包含bFGF和ROCK抑制剂的第三组合物，以获得永久HE细胞；

其中所述永久HE细胞能够提供造血细胞系，其包括造血干和祖细胞(HSC)；

其中中胚层细胞和具有永久HE潜能得中胚层细胞在步骤(i)和(ii)中获得，而不形成拟胚体；以及

其中所述多能干细胞向造血细胞系的分化不含TGFβ受体/ALK抑制剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中该造血细胞系包括造血干和祖细胞(HSC)、造血专能祖细胞(MPP)、前-T祖细胞、前-NK祖细胞、T祖细胞、NK祖细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞或B细胞。

3.如权利要求1所述的方法，进一步包括：

(i)使多能干细胞接触包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物，以接种和扩增细胞；或

(ii)使多能干细胞、中胚层细胞和/或具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞处于2％至10％的低氧张力下。

4.如权利要求1所述的方法，进一步包括：

(i)使永久HE细胞接触包含BMP激活剂，以及可选的ROCK抑制剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物，以获得造血专能祖细胞(MPP)；或

(ii)使永久HE细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子；以及可选的ROCK抑制剂的组合物，以获得前-T祖细胞、T祖细胞和/或T细胞；或

(iii)使永久HE细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7和IL15的生长因子和细胞因子以及可选的一种或多种BMP激活剂、ROCK抑制剂、VEGF和bFGF的组合物，以获得前-NK祖细胞、NK祖细胞和/或NK细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其中

(i)多能干细胞向造血细胞系的分化处于无饲养条件下；或

(ii)多能干细胞向造血细胞系的分化处于无基质条件下；或

(iii)多能干细胞包括诱导性多能干细胞(iPSC)，可选地其中iPSC是初始iPSC；或

(iv)WNT途径激活剂是GSK3抑制剂，可选地其中GSK3抑制剂是CHIR99021；或

(v)BMP途径激活剂是BMP4。

6.如权利要求1所述的方法，其中ROCK抑制剂是：(i)Thiazovivin，或(ii)Y-27632。

7.如权利要求1所述的方法，包括：

使多能干细胞来源的前-T祖细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子的组合物，以获得多能干细胞来源的T祖细胞或T细胞，其中组合物不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种；

其中多能干细胞来源的前-T祖细胞通过使永久造血内皮接触包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子的组合物产生，以允许细胞分化和扩增。

8.如权利要求7所述的方法，其中：

(a)所述方法进一步包括

使所述多能干细胞接触包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物以接种和扩增多能干细胞，其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂；或

(b)其中产生多能干细胞来源的T细胞系(i)不产生拟胚体；(ii)于单层培养下进行；(iii)于无饲养条件下进行；或(iv)于无基质条件下进行；或

(c)其中多能干细胞是iPSC或初始iPSC。