[发明专利]单链DNA产物的调制方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于基因检查的、将单链DNA通过连接反应、特别是循环连接反应(CLR)进行扩增的技术。

背景技术

分析样本(検体)的核苷酸序列(塩基配列)再进行判定的基因检查在基础研究、医疗、食品等领域广泛应用。更具体而言，其用于检测突变、判定基因多态性(在人或动物中是指变化频率为1%以上的基因)、检测病原菌、检查是否存在基因重组等。例如，认为基因多态性的判定可以事先预测药物的副作用或效果，从而在医疗现场等中开始有效运用。

基因检查典型的是利用使用了实时PCR设备的TaqMan法或QP法、使用了DNA微阵列的方法(DigiTag法等)等来进行。但是，这些方法均需要技术学习、高价的荧光检测设备，因此虽然进行了委托分析，但在医疗现场等难以有效运用，这是现状。

另外，公开了在固定有寡核苷酸的固相上检测靶核酸的方法(专利文献1、专利文献2)。这里所说的“固相”是指想要使寡核苷酸在硝酸纤维素膜或尼龙膜等可固定寡核苷酸的膜上结合成线条状或斑点状的所谓“条带”，具体例子有被称作PAS(Printed Array Strip，印刷阵列条带)的条带。根据核酸层析法的原理，将通过PCR调制的DNA产物在该条带上展开，通过杂交可进行检测。在该方法中，调制的DNA产物具有以下特征：形成双链，在其DNA产物的一条链的末端添加单一标签。但是，由于是通过PCR扩增靶双链DNA序列，因此虽然灵敏度(反应性)高，但存在着以下问题：容易产生引物二聚体等非特异性扩增产物，精度(准确性)低。

为了在临床现场等简易地进行基因分析，有必要提供即使通过这样的简易的方法也能够检测的、高精度的核酸样品的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利5503021号；

专利文献2：国际公开第2012/070618号；

专利文献3：日本专利3103806号；

专利文献4：日本特开2006-101844号；

专利文献5：日本特公平6-36760号；

专利文献6：日本专利3330599号。

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于：提供一种即使在临床现场等也可简易且正确地进行检查的可进行基因分析的单链DNA产物的调制方法的技术。

例如，在现有的条带技术中，使作为靶的DNA扩增，将已扩增的DNA产物在条带上“展开”，通过条带上的寡核苷酸与DNA产物发生杂交来进行判定。在该技术中，通过PCR大量扩增作为靶的DNA，在条带上展开其DNA产物。因此，为了在条带上进行DNA产物的检测，必须通过PCR进行扩增。但是，在通过PCR扩增的DNA产物中，往往会产生引物二聚体等非特异性DNA产物，在条带上检测到本来检测不到的DNA，存在着发生误判的问题。

另外，在使用条带检测SNP(单核苷酸多态性)时采用以下方法：通过使PCR中使用的引物的3’末端与SNP所对应的碱基配合，扩增SNP所对应的双链DNA。但是，在SNP的PCR的扩增工序中，有时会错误地发生引物的杂交，出现精度进一步降低的问题。

而且，在使用了条带的检测中，还考虑使用单链DNA序列进行检测的方法。例如考虑如下：在单链DNA的一个末端添加单一标签、在另一末端添加标记物质，通过PCR扩增的双链DNA产物通过热变性分离成单链DNA而获取。但是，在该方法中，在PCR中出现上述问题，不仅精度降低，而且DNA产物还因热变性而发生分离，因此将其在条带上展开时，已分离的单链DNA的一部分又返回到双链DNA中，出现灵敏度进一步降低的问题。

因此，确立在临床现场等可以简易且高精度地进行检查的DNA检测技术是重要课题之一。特别是，谋求调制还能够用于使用了条带的基因检查技术的样品，所述基因检查技术不需要大的装置等，在临床现场等可以简易且高精度地进行检查。

为了解决上述课题，本发明人着眼于：在用于检查的样品中不制作双链DNA产物，从而不扩增引物二聚体等非特异性双链DNA产物。因此，通过连接扩增，来研究开发极少引起误判定的单链DNA产物的调制方法。

一直以来都存在获得单链DNA的技术。作为有名的技术，可以列举Digitag法(专利文献3、专利文献4)及LCR(专利文献5、专利文献6)这样的技术。但是，在这些技术中，可知用于反应的寡核苷酸非特异性地与核酸样品结合，而在条带上被误判为假阳性。