[发明专利]利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法

说明书

本发明涉及一种利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，包括如下步骤：(a)将相互不混合的第一物质和第二物质混合于体液或具有细胞外囊泡的水溶液中，从而制造双水相体系；(b)对所述双水相体系中浓缩于第二物质的细胞外囊泡进行分离。利用所述双水相体系的细胞外囊泡的分离方法与现有技术相比，具有非常高的效率，且具有分离方式简单、所需时间非常短的优点。本发明的利用双水相体系的细胞外囊泡的分离不需要超速离心分离机，在约10～20分钟的短时间内几乎以100％的效率实现细胞外囊泡的分离，因此，相比于现有的其他分离方法具有以下优点：实用、因花费少而经济的同时能够提高因蛋白质而受到污染的细胞外囊泡的纯度，不仅可以通过分离的细胞外囊泡来诊断疾病，而且可以适用于利用细胞外囊泡的多种领域。

政府支持

本发明得到美国国立卫生研究院授予的拨款EP005582的支持。政府享有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，更加详细地，提供一种利用所述方法能够在短时间内迅速地分离细胞外囊泡且还可以提高因蛋白质而受到污染的细胞外囊泡的纯度的方法。

背景技术

在细胞外囊泡中有外泌体(exosomes)或微泡(microvesicles)等，大小为50～1000nm，具有原来的细胞所具有的特性，因此，作为诊断疾病的标志物(marker)受到关注。

作为现有的分离细胞外囊泡的技术有超速离心分离(ultracentrifugationisolation)、尺寸排阻法(size exclusion)、免疫亲和性分离(immunoaffinityisolation)、微流体芯片技术(microfluidics chip)及利用聚合物的方法(polymericmethod)等。其中，超速离心分离是分离细胞外囊泡时最为广泛使用的方法，是原理简单且最具可信性的分离方法。

但是，利用所述超速离心分离对细胞外囊泡进行分离时具有以下缺点：细胞外囊泡的收率低，分离时所需时间长，且需要昂贵的机器。

就尺寸排阻法而言，主要和超速离心分离法一起使用，虽然具有简单地提高细胞外囊泡的纯度的优点，但局限在于细胞外囊泡粘附于过滤器并分离后的收率低。

免疫亲和性分离法作为使得抗体粘附于细胞外囊泡而进行分离的方法，虽然可以通过非常高的筛选特性(specificity)进行分离，但制造抗体的过程需要很长时间且花费较多费用，因此不适合使用于实用性的诊断。

为了克服所述现有技术的问题，本发明的发明人在公开专利第2014-0050465号中提出了一种涉及分离细胞外囊泡的微流体芯片的技术。作为利用由记载于所述专利文献的抗体所涂敷的微流体芯片而使得细胞外囊泡从血清中分离出来的方法，虽然具有细胞外囊泡的分离所需的时间少且不需要单独准备研究室而在经济方面有利的优点，但是所述方法也是从收率较低这点来说，作为既实用又经济的诊断方法来使用仍然存在需要改进的问题。

另外，利用聚合物的方法作为通过降低体液(body fluid)的溶解度来使得细胞外囊泡沉淀的技术，需要较长的准备时间(incubation time)，且连蛋白质也一起沉淀，因而沉淀物的纯度不佳，不适宜用于诊断。

发明内容

本发明涉及一种利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，从体液中分离细胞外囊泡时，提出一种相比于现有技术以高纯度在短时间内迅速地进行分离的技术。

更为详细地进行说明，现有的细胞外囊泡分离技术具有收率低、诱发杂质污染(impurity contamination)的问题，为了通过与现有技术完全不同的方式对细胞外囊泡进行分离，本发明中提出一种利用双水相体系的方法。所述双水相体系可以在短时间内有效地对相互不同种类的粒子(particles)进行分离，因此，经常被使用于分离粒子，但是通过双水相体系来分离细胞外囊泡的研究尚未被报道。