[发明专利]分析用试样的调制方法和分析方法

说明书

本发明的分析用试样调制方法中，当分析对象物质的糖链中结合有唾液酸时，根据唾液酸的结合方式，进行会生成不同修饰体的反应。该反应中使用含有糖链的分析对象物质、含有2个碳原子的胺以及脱水缩合剂。通过质量分析等对所获得的分析用试样进行分析，由此可以识别唾液酸的结合方式。本发明的分析用试样调制方法不仅可以适用于游离糖链，还可以适用于糖肽和糖蛋白。

技术领域

本发明涉及分析用试样的调制方法、以及使用所获得的分析用试样的分析方法。

背景技术

肽链上的糖链附加是翻译后修饰中最重要的工序之一。肽链上附加了糖链的糖蛋白与各种各样的生命现象息息相关。人们认为在生物体内，通过精确识别糖链的细微结构差异，可以控制细胞间的信号传递和分子识别等，并期待糖蛋白和糖肽的结构解析给生命现象的阐明和药物研发、生物标记物开发等带来巨大的贡献。

与蛋白质的天冬酰胺残基结合的N-结合型糖链具有至少1个支链，大多数在非还原末端上具有唾液酸。由于糖链非还原末端的唾液酸直接关乎分子识别，因而分析唾液酸的有无(唾液酸的数量)及其结合方式在糖蛋白和糖肽的结构解析中至关重要。

由于唾液酸带负电荷，容易产生因不稳定而分解和从糖链脱离，故而有人提出了若干在对唾液酸进行化学修饰而稳定化之后再进行分析的方法。例如，专利文献1中公开了一种将游离糖链的还原末端固定于固相载体上，使用PyAOP作为缩合剂，使用甲胺盐酸盐作为亲核试剂，将糖链非还原末端的唾液酸的羧基进行甲酰胺化的方法。另外，专利文献1中公开了通过将甲基酰胺修饰后的试样供给至质量分析以进行糖链的定量和结构分析的例子。

专利文献2中记载了，通过由在鏻盐等脱水缩合剂存在下的反应，将糖肽中存在的所有羧基进行修饰化(或除去)，来抑制质量分析(离子化)时的唾液酸的脱离。另外，专利文献2中还记载了，通过将修饰后的试样供给至多阶段的质量分析，可以解析其中糖链含有唾液酸的糖肽的糖链支链结构。

质量分析是对糖链的结构解析有效的分析法，如上所述，通过对非还原末端的唾液酸进行修饰而使结构稳定化，也可以分析唾液酸的有无以及糖链的支链结构。另一方面，上述专利文献1和专利文献2中所述的方法，由于进行了与唾液酸的结合方式无关的甲酰胺化，故而无法识别唾液酸的结合方式。

作为唾液酸结合于糖链非还原末端的结合方式，主要存在α2，3－与α2，6－的结合异构。已知在生物体中，唾液酸的结合方式的不同关乎各种各样的生命现象，例如已知随着癌化，唾液酸的结合方式也产生变化。因此，即便在作为生物标记物的利用和生物医药品的质量管理等中，识别唾液酸的结合方式的差异也受到关注。

为了通过质量分析识别唾液酸的结合方式，需要进行结合方式特异的修饰，使之根据结合方式而具有不同的质量。例如，专利文献3中，有人提出了以下方法：在使用1－甲基－3－对甲苯基三氮烯(MTT)进行唾液酸的甲酯化后，定为酸性条件。该方法中记载了：在酸性条件下，由于选择性地仅将α2，3－唾液酸进行脱甲基化，故而可以识别α2，3－唾液酸与α2，6－唾液酸。

另外，也有人提出了以下方法：在脱水缩合剂的存在下，利用α2，3－唾液酸通过分子内脱水缩合而容易生成内酯环，通过质量分析来识别唾液酸的结合方式。例如，非专利文献1和非专利文献2中公开了，通过使糖链试样与脱水缩合剂存在于甲醇或乙醇中，α2，6－唾液酸被优先酯化，α2，3－唾液酸优先通过分子内脱水来生成内酯环。非专利文献3中公开了以下方法：通过糖链试样与氯化铵的反应，将α2，3－唾液酸和α2，6－唾液酸内酯化和酰胺化后，将它们完全甲基化。如果利用这些修饰方法的话，α2，3－唾液酸的修饰化合物与α2，6－唾液酸的修饰化合物具有不同的质量，故而能够通过质量分析来识别唾液酸的结合方式。

[现有技术文献]

[专利文献]

专利文献1：日本专利特开第2013-68594号公报

专利文献2：日本专利特开第2015-34712号公报