[发明专利]用于治疗神经退行性疾病的干细胞衍生多巴胺能细胞的生产方法和组合物

说明书

本发明涉及生产多巴胺能细胞和评价其功能的方法。在包被有层粘连蛋白‑111、层粘连蛋白‑121、层粘连蛋白‑521、层粘连蛋白‑421或层粘连蛋白‑511的培养板上，使用含有GSK3抑制剂和TGF‑β抑制剂并适时施加成纤维细胞生长因子的培养基来培养多能人胚胎干细胞，此时所需神经细胞以更高的速率产生。本发明还描述了用于生产这种多巴胺能细胞的有用的细胞培养试剂盒，以及使用这种细胞进行干细胞治疗的方法。

相关的申请的交叉引用

本申请要求于2015年2月25日递交的美国临时专利申请号 62/300,000、2015年6月19日递交的美国临时专利申请号62/182,051 以及2015年4月9日递交的美国临时专利申请号62/145,467的优先 权，通过引用将前述申请的全部公开内容并入本文。

背景技术

通过引用将文件名为“Seq_List_LCTI_200040USP3_ST25.txt” 的ASCII文本文件中的材料并入本申请，该文件创建于2006年2月 10日，文件大小为8,781字节。

本发明涉及由人类多能干细胞(hESCs)生产某些所需的多巴胺 能细胞的方法，以及基于分子标志物预测其移植至脑部后的表型成熟 的方法。这些多巴胺能细胞可用于基于干细胞的治疗，例如治疗包括 帕金森病在内的神经退行性疾病。本发明还公开了用于实施该方法的 试剂盒。通常，在层粘连蛋白-111(或其他重组生产的层粘连蛋白) 的基底上培养干细胞，并将这些干细胞暴露于多种细胞培养基中，以 便比此前方法更高效地获得多巴胺能细胞。

层粘连蛋白是主要存在于基膜的异三聚体糖蛋白家族。它们通 过与一侧相邻细胞受体结合相互作用，以及与其他层粘连蛋白分子或 其他基质蛋白(例如胶原、巢蛋白或蛋白聚糖)结合来起作用。层粘 连蛋白分子也是重要的信号转导分子，可以强烈影响细胞的行为和功 能。层粘连蛋白在维持细胞/组织表型方面，以及在组织修复和发育 中促进细胞生长和分化方面都很重要。

层粘连蛋白是一类多结构域的大蛋白，具有共同的结构组织。 层粘连蛋白分子包括一个α链亚基、一个β链亚基和一个γ链亚基， 它们通过一个卷曲螺旋结构域连接形成三聚体。在天然组织中，十二 种已知的层粘连蛋白亚基链可以形成至少15种类型的三聚体层粘连 蛋白。在三聚体层粘连蛋白结构内具有与其他层粘连蛋白和基膜分子 结合活性的可识别结构域以及膜结合受体。图1分别示出了三种层粘 连蛋白链亚基。例如，结构域VI、IVb和IVa形成球状结构，而结 构域V、IIIb和IlIa(其含有富含半胱氨酸的EGF样元件)形成棒状 结构。三条链中的I和II结构域参与形成三股铰链卷曲螺旋结构(长 臂)。

在人组织中存在五种不同α链、三种β链和三种γ链，已经发 现了至少十五种它们的不同组合。基于它们的历史发现顺序，这些分 子被命名为层粘连蛋白-1至层粘连蛋白-15，而另一种命名法依据其 链的组成描述了其异构体，例如包含α-1、β-1和γ-1链的层粘连蛋白 -111(层粘连蛋白-1)。已经确定出四个由结构定义的层粘连蛋白家 族组。五个已确定的层粘连蛋白分子构成第一组，它们的β1和γ1 链相同，而α链组成不同(α1至α5链)。包括层粘连蛋白-521在内 的五个已确定的层粘连蛋白分子构成第二组，它们的β1和γ1链相同， 而α链组成不同。已确定的层粘连蛋白分子的第三组只有一个已确定 的成员，层粘连蛋白-332，其链组成为α3β3γ2。已确定的层粘连蛋 白分子的第四组只有一个已确定的成员，层粘连蛋白-213，其具有新 识别出的γ3链(α2β1γ3)。

人类胚胎干细胞(hES)为多种疾病的再生医学发展提供了希望， 所述疾病如脊髓和心脏损伤、I型糖尿病和诸如帕金森病之类的神经 退行性疾病等。干细胞是一种未分化的细胞，其可分化成为特化的细 胞。胚胎干细胞具有广泛的自我更新能力和多能性，具有分化成所有 三种胚层的细胞的潜力，其可用于治疗目的，并且可以为组织替代疗 法、药物筛选、功能基因组学和蛋白质组学提供无限的细胞来源。