[发明专利]用于减少非特异性扩增产物的方法和组合物

说明书

相关申请的交叉引用

本专利申请要求以下临时专利申请中的每一项的优先权：美国临时专利申请号62/114,788，标题为“用于在多重PCR中消除非特异性扩增产物的方法”，并于2015年2月11日提交；和美国临时专利申请号62/150,600，标题为“用于减少非特异性扩增产物的方法和组合物”，并于2015年4月21日提交。这些临时申请的每一项都通过引用全文并入本文。

通过引用并入

本说明书中提及的所有出版物和专利申请都以如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入的相同程度，通过引用全文并入本文。

技术领域

本文所述的方法、组合物、系统和试剂盒涉及核苷酸序列的扩增。特别地，本文所述的方法、组合物、系统和试剂盒涉及在扩增多个不同核苷酸区域时，例如在包括下一代测序(NGS)的多重PCR期间，减少非特异性扩增产物(例如引物二聚体)。

背景技术

在单重(uniplex)PCR反应(以下称为单重PCR)中，反应通常含有模板DNA、位于单一扩增位点侧面的两个引物、热稳定DNA聚合酶、dNTP和缓冲液。所得扩增产物(扩增子)通常是靶DNA片段。偶然的非特异性扩增产物通常通过微调PCR条件如退火温度、镁浓度或通过更严格的引物设计而除去。

多重PCR是指在相同的管或孔中同时扩增多个靶DNA片段。这涉及将多于一对引物放在一起。在实际应用中，通常预期从数十到数万种不同种类的靶DNA片段在单个管中同时扩增。当需要在单个管中一起扩增不同的DNA片段时，多重PCR提供相对于单重PCR非凡的简易性、通量和经济优势。当处理珍贵样品(例如临床样品)时也经常使用其。

多重PCR已经在物种鉴证中广泛应用于人类、动物、作物和植物中基因和微生物的检测和临床诊断，且最近广泛应用于下一代测序(包括但不限于，从头测序和靶向重测序)的样品和文库制备。在基因测试和诊断中，多重PCR用于单核苷酸多态性(SNP)、基因分型、拷贝数变异、表观遗传学、基因表达以及突变和杂交阵列的分析。

多重PCR通常需要将相同体积中的一定浓度的大量引物放在一起。当使用数千引物时，这些引物积累至非常高的量，例如至多数微克。多重PCR的难点在于这些引物可以相互退火，导致产生大量非特异性扩增产物。这些非特异性扩增产物通常使得靶片段不可检测，或者纯粹是取消了靶片段的产生。

尽管存在这些大量引物和所产生的背景“噪音”的问题，但使得多重PCR可行的现有技术可以包括在非常窄的参数范围内特别设计引物、和/或引入外来标记物(例如，美国专利号8,586,310和8,673,560，描述了通过用尿苷替代胸苷修饰引物，使得非特异性产物主要由具有沿其长度散布的多个尿苷的引物的非特异性退火形成，并且可以在此基础上被特异性靶向)、使用用于预防或减少引物二聚体形成的寡核苷酸(参见例如WO 2015063154 A1)、以及使用被通用引物组合封闭的标记的、靶特异性引物和特异性激活封闭引物的策略(参见例如US20140329245)。所有这些技术均具有实质性的缺点和局限性。

例如，用于在核酸扩增期间避免或减少人造物(例如引物二聚体)形成的方法以引物设计过程为中心，并且经常利用专用软件包(例如，DNAsoftwares的Visual OMP、MultiPLX，ABI的Primer Express等)设计被预测在扩增期间在池中其它引物之间表现出最小相互作用的引物对。通过使用这样的软件，可以将引物设计为尽可能具有靶特异性或扩增子特异性，并且通常被分组成子集以最小化引物-引物相互作用、引物二聚体形成和超级扩增子。然而，严格的设计参数限制了可以同时共同扩增的扩增子的数量，并且在一些情况下可能完全阻止一些扩增子的扩增。其他当前方法需要使用多个PCR引物池以将引物分隔到不重叠的池中，以在扩增步骤期间最小化或防止引物人造物。其他方法包括使用多个引物池或单重(single plex)反应以提高每个反应的扩增产物的总产量。