[发明专利]基于LNA的突变型富集下一代测序测定

权利要求书

1.一种检测双链DNA分子(dsDNA)的靶序列中的突变的方法，该方法包括：

提供包含dsDNA的样品；

使该样品与以下项接触：

包含第一半功能NGS适配子序列的正向基因特异性引物，以及

任选地包含一种或多种锁核苷酸的钳寡核苷酸，其中该正向引物和钳寡核苷酸是顺式的，并且其中该钳寡核苷酸与疑似包含一个或多个突变的区域中的靶基因的野生型序列杂交；

进行第一轮的单链引物延伸PCR，以产生第一群体的扩增子；

任选地纯化该第一群体的扩增子；

使该第一群体的扩增子与以下项接触：

与该第一半功能NGS适配子序列的一部分互补的第一通用引物，其中用该引物进行的扩增产生第一全功能NGS适配子序列，

包含第二半功能NGS适配子序列的反向基因特异性引物，其中该反向引物相对于与该第一NGS适配子序列的一部分互补的引物是反式的，以及；

与该反向引物上的该第二半功能NGS适配子序列互补的第二通用引物，其中用该第二通用引物进行的扩增产生第二全功能NGS适配子序列；

进行第二轮的PCR(“PCR2”)，以完成包含第一和第二全功能NGS适配子序列二者的第二群体的扩增子的扩增；

对该第二群体的扩增子进行测序；并且

将该第二群体的扩增子的序列与参考野生型靶序列进行比较；

由此检测该靶序列中的突变。

2.如权利要求1所述的方法，其中该dsDNA是或包括基因组DNA。

3.如权利要求1所述的方法，其中该dsDNA来自优选在血浆或尿中的循环肿瘤DNA(ctDNA)；循环肿瘤细胞(CTC)；或外来体。

4.如权利要求1所述的方法，其中纯化该第一群体的扩增子包括使用基于固相可逆固定化(SPRI)珠的清除。

5.如权利要求1所述的方法，其中该靶序列在雌激素受体1(ESR1)中，优选地在配体结合域中。

6.如权利要求5所述的方法，其中该靶序列包括ESR1野生型序列TGCCCCTCTATGACCTGCTG(SEQ ID NO:1)。

7.如权利要求5或6所述的方法，进一步包括将ESR1中有突变的受试者鉴定为患有对内分泌疗法有抗性的雌激素受体(ER)阳性乳癌或处于发展该病的风险中。

8.如权利要求5或6所述的方法，进一步包括将ESR1中有突变的受试者鉴定为不太可能对用内分泌疗法进行的治疗有反应。

9.如权利要求5或6所述的方法，进一步包括选择并且任选地将不包括内分泌疗法的疗法给予至已经被鉴定为ESR1中有突变的受试者。

10.如权利要求1所述的方法，其中该靶序列在磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶，催化亚基α(PIK3CA)中，任选地在外显子9和/或20中。

11.如权利要求10所述的方法，其中该靶序列包括PIK3CA外显子9野生型序列：TCTCCTGCTCAGTGATTTCA(SEQ ID NO:8)或PIK3CA外显子20野生型序列：TGCACATCATGGTGGCTGGA(SEQ ID NO:9)。

12.如权利要求10或11所述的方法，进一步包括将PIK3CA中有突变的受试者鉴定为患有对用曲妥珠单抗和/或拉帕替尼进行的治疗无反应的雌激素受体(ER)阳性乳癌或处于发展该病的风险中。

13.如权利要求10或11所述的方法，进一步包括将PIK3CA中有突变的受试者鉴定为不太可能对用曲妥珠单抗和/或拉帕替尼进行的治疗有反应。

14.如权利要求10或11所述的方法，进一步包括选择并且任选地将不包括曲妥珠单抗和/或拉帕替尼的疗法给予至已经被鉴定为PIK3CA中有突变的受试者。