[发明专利]甜菊醇糖苷的酶修饰的方法、由此可获得的修饰的甜菊醇糖苷及其作为甜味剂的用途

说明书

本发明通常涉及甜菊醇糖苷的产生。提供了酶促地提供修饰的甜菊醇糖苷的方法，包括在蔗糖和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株180的葡聚糖蔗糖酶GTF180或其具有期望的转糖基化活性的突变体的存在下，孵育甜菊醇糖苷底物。还提供了通过本发明的方法能够获得的修饰的甜菊醇糖苷，以及其作为低血糖甜味剂的用途。

本发明一般涉及甜菊醇糖苷的产生。特别地，本发明涉及将甜菊醇糖苷经酶修饰成为新型甜菊醇糖苷的方法，以及所述新型甜菊醇糖苷作为甜味剂的用途。

甜味剂作为食品、饮料或糖果工业中最常用的成分是众所周知的。甜味剂可以在生产过程中掺入最终的食品产品中，或者可以独立使用，例如，当进行适当的稀释或作为餐桌甜味剂时。甜味剂包括诸如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、槭糖浆和蜂蜜的天然甜味剂，以及诸如阿斯巴甜、糖精和三氯蔗糖的人造甜味剂。

草本植物甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)(一种菊科[Asteraceae/Compositae]家族的根茎型多年生灌木)的叶含有很多种天然甜味化合物，即甜菊醇糖苷(Brandle等人，1998)。甜菊苷(干燥叶的5％w/w-10％w/w)和瑞鲍迪甙(Rebaudioside)A(干燥叶的2％w/w-4％w/w)是最丰富的，并且它们的味道比蔗糖(0.4％水溶液)甜约200倍–300倍。因此，可以将它们视为蔗糖和人造(合成)甜味剂的“生物”替代物(Geuns 2003；Goyal等人，2010；Puri等人，2011)。

除了甜味之外，一些甜菊醇糖苷在较高剂量和规律的消耗下，具有多种多样的药理性质，例如抗氧化、抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、胃保护(止泻)的性质，并且它们似乎对肾功能、血压和血糖水平具有积极效果(Chatsudthipong和Muanprasat 2009；Madan等人，2010；Brahmachari等人，2011；Lemus-Mondaca等人，2012；Shivanna等人，2013)。它们可以对患有肥胖、糖尿病、高血压、苯丙酮尿症、心脏疾病和龋齿的人有益处(Yadav和Guleria2012)。甜菊醇糖苷是无热量的、非致癌的、非遗传毒性的，并且与人的任何生殖毒性/发育毒性无关(European Food Safety Authority,2010)。

在结构上，甜菊醇糖苷具有对映-13-羟基贝壳杉-16-烯-19-酸作为糖苷配基，但是在碳水化合物组成上不同(参见图1)。

13-叔羟基处的葡萄糖单元数与19-羧基处的葡萄糖单元数的比似乎与甜菊醇糖苷的甜味以及味道品质有关(Darise等人，1984)。例如，瑞鲍迪甙A比甜菊苷苦味更小。甜菊苷的酶促葡萄糖基化研究显示，糖苷键特异性也影响甜菊醇糖苷的感官性质。Fukunaga等人(1989)发现，甜菊苷在C-13位的单-(α1→4)-葡萄糖基化和双-(α1→4)-葡萄糖基化均得到了在甜味的强度和品质上均有显著改善的产物。然而，在C-19位的单-(α1→4)-葡萄糖基化和双-(α1→4)-葡萄糖基化均导致了增强的苦味和较低的甜味强度(Fukunaga等人，1989)。另一方面，α-连接的葡萄糖与C-19位的葡萄糖单元的C-6羟基的连接导致了味道品质的显著改善(Lobov等人，1991)。明显地，糖苷键的端基异构(anomericity)不会大程度地影响甜味和苦味，因为若干最近的研究显示，瑞鲍迪甙D和瑞鲍迪甙M(分别在19-O-葡萄糖基部分额外有一个和两个β-连接的葡萄糖单元的两种瑞鲍迪甙A衍生物)均具有比瑞鲍迪甙A和许多其他甜菊醇糖苷更理想的味道特征(Hellfritsch等人，2012；US2013/00771521A1；WO2014/122227；Prakash等人，2014)。与瑞鲍迪甙A相比，瑞鲍迪甙D在水和碳酸饮料基质中具有增强的甜味和减弱的苦味。与瑞鲍迪甙A相比，瑞鲍迪甙M在水溶液中显示出减弱的苦味，但显示出类似的甜味强度。在酸化的水中，与瑞鲍迪甙A相比，感觉到减弱的苦味和增强的甜味(Prakash等人，2014)。此外，(α1→2)-(瑞鲍迪甙E)-或(β1→2)-(瑞鲍迪甙E)-连接的葡萄糖与甜菊苷的C-19位的葡萄糖单元的C-2羟基的连接改进了甜菊苷的感官产物，产生具有类似甜味但具有减弱的苦味的化合物(Ye等人，2013)。