[发明专利]羟基-L-哌可酸的制造方法

说明书

本发明的课题在于提供抑制羟基‑L‑脯氨酸的生成、高效且以低成本廉价地制造高纯度的羟基‑L‑哌可酸的新方法。本发明提供一种羟基‑L‑哌可酸的制造方法，其为在α‑酮戊二酸和二价铁离子的存在下使L‑哌可酸羟化酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或对该微生物或细胞进行培养而得到的含有该酶的培养液作用于作为底物的L‑哌可酸而生成羟基‑L‑哌可酸的方法，L‑哌可酸羟化酶具有下述(1)和(2)的特征。(1)能够在α‑酮戊二酸和二价铁离子的存在下作用于L‑哌可酸，在L‑哌可酸的3位、4位和/或5位的碳原子上添加羟基。(2)对L‑脯氨酸的催化反应效率(kcat/Km)为对L‑哌可酸的催化反应效率(kcat/Km)的7倍以下。

技术领域

本发明涉及利用生物学方法制造羟基-L-哌可酸的方法，具体而言，涉及使用具有生产羟基-L-哌可酸的能力的酶由L-哌可酸制造羟基-L-哌可酸的方法。

背景技术

羟基-L-哌可酸是作为用于合成药品的中间体等有用的化合物。例如，已知(4S)-羟基-L-哌可酸可用作Rho激酶抑制剂的前体(专利文献1)、(4R)-羟基-L-哌可酸可用作HIV蛋白酶抑制剂帕利那韦(palinavir)的前体(非专利文献1)、(5S)-羟基-L-哌可酸和(5R)-羟基-L-哌可酸可用作抗菌剂的前体(专利文献2)。

已知羟基-L-哌可酸可以通过生物学方法由L-哌可酸进行制造。例如据报道，百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)MAFF303099来源的BAB52605蛋白质、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)1021来源的CAC47686蛋白质(以下有时称为“SmPH”)和褶皱慢反应脂肪酸菌(Segniliparus rugosus)ATCC BAA-974来源的EFV12517蛋白质的注释的上游48个碱基(相当于16个氨基酸)开始表达的多核苷酸(cis基因)所编码的蛋白质(以下有时称为“SruPH”)等具有将L-哌可酸转变为(5S)-羟基-L-哌可酸的能力(专利文献3)，使用这些羟化酶能够将L-哌可酸转变为羟基-L-哌可酸。

但是，这些羟化酶也均具有将L-脯氨酸羟化而生成羟基-L-脯氨酸的能力。

在此，使用酶、菌体等利用生物学方法制造的L-哌可酸中有时会微量混入例如作为来自酶、菌体的制备时使用的培养基等的带入成分的L-脯氨酸。

另外，在以纯的L-哌可酸作为原料使用羟化酶制造羟基-L-哌可酸的情况下，有时在所使用的羟化酶中混入有L-脯氨酸。

此外，即使在作为原料的L-哌可酸、羟化酶均不含有L-脯氨酸的情况下，在一边使表达羟化酶的菌体生长一边进行反应的情况下，认为在其生长过程中菌体也会副生成L-脯氨酸。

L-脯氨酸与L-哌可酸的物理化学性质接近，因此难以将L-脯氨酸完全除去而得到纯的L-哌可酸。

另外，在以混入有L-脯氨酸的L-哌可酸作为原料、使用上述的酶将L-哌可酸转变为羟基-L-哌可酸的情况下，L-脯氨酸被转变为羟基-L-脯氨酸，因此，产物中混杂存在羟基-L-哌可酸和羟基-L-脯氨酸，难以得到高纯度的羟基-L-哌可酸。另外，羟基-L-脯氨酸与羟基-L-哌可酸的物理化学性质接近，因此难以将两者分离。

因此，为了除去羟基-L-脯氨酸而得到高纯度的羟基-L-哌可酸，需要多次重复纯化或者使用昂贵的纯化方法，因此纯化的负荷高，存在时间上成本上的负担都大的问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2010-514720号公报

专利文献2：日本特表2004-505088号公报

专利文献3：WO2013/187438

非专利文献