[发明专利]在低温下保存细胞、组织或器官的方法

说明书

本发明涉及一种用于在重度低温下保存优选人类细胞、组织或器官的方法，其包含如下步骤，在所述步骤期间将所述细胞、组织或器官保持在中度低温以及优选低氧和/或高二氧化碳氛围下，然后将所述细胞、组织或器官放置在重度低温下。

本发明涉及一种用于中期和长期保存细胞、组织或器官的新方法。更具体地，该方法旨在用于保存移植物，直到它们移植在接受者中。

背景技术

迄今为止，低温保存是用于中期和长期保存造血细胞移植物的唯一可用的方法。实际上，在未冷冻并且在4℃的温度下，观察到，在保存仅3天后，移植物中所含的祖细胞的数量和功能能力急剧降低(Hechler等人,1996)。

然而，低温保存具有显著的缺点，特别是融化期间可能会凝集或因存在低温保护剂而引起过敏反应的风险。此外，该方法不适用于所有细胞类型。

以前的研究显示，通过改变培养物的氛围条件，特别是通过降低氧气浓度和提高二氧化碳浓度能改善CD34⁺造血干细胞在4℃下的短期保存(Vlaski等人，2014)。虽然是显著的，但这些改善仍然不足以确保在4℃下长期保存时细胞并且特别是祖细胞的存活和功能能力的维持。

最佳方法将允许在不冷冻的情况下在低温条件下长期保存移植物，并由此简化移植流程和程序，同时改善在接受者中获得的结果。

发明内容

发明人已显示，将细胞在中度低温以及低氧和/或高二氧化碳氛围下预温育，然后将细胞保存在重度低温下，使得可以大幅改善所述细胞的存活和增殖能力，特别是在干细胞的情况下。

因此，根据第一方面，本发明涉及一种用于在重度低温下保存动物细胞、优选人类细胞的体外或离体方法，其包含如下步骤：将所述细胞维持在中度低温以及低氧和/或高二氧化碳氛围下约12至约72小时，然后将所述细胞保存在重度低温下。

可以将细胞保存在温度为约1℃至约12℃、优选约4℃的重度低温下。

可以将细胞维持在温度为约20℃至约35℃、优选约30℃的中度低温下。

可以将细胞维持在中度低温以及低氧和/或高二氧化碳氛围下约24至约48小时，优选约48小时。

低氧氛围可以包含约0.5％至约10％O₂，优选约5％O₂。

高二氧化碳氛围可以包含约5％至约20％二氧化碳，优选约9％二氧化碳。

优选地，将细胞维持在中度低温以及低氧和高二氧化碳氛围下。

根据本发明方法保存的细胞可以是皮肤细胞、软骨细胞、骨细胞、内皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、视网膜细胞、胰腺细胞、血细胞或能够分化成这些细胞的干细胞或祖细胞。

这些细胞可以特别地被组织成组织，所述组织优选选自：皮肤、角膜、肌腱、骨组织、血管、神经、心脏瓣膜、羊膜、软骨组织、朗格罕氏岛(islet of Langerhans)和肌肉组织；或被组织成完整或部分器官，所述器官优选选自：肾脏、肝脏、心脏、脐带、胎盘、肠、肺和胰腺。

优选地，保存的细胞是造血干细胞、间充质干细胞或其组合，优选造血干细胞。

根据另一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包含细胞保存介质；用于接收细胞、组织或器官和细胞保存介质的第一无菌容器；用于在包含细胞、组织或器官的第一容器中产生低氧和/或高二氧化碳氛围的装置；以及任选地，用于将第一容器和/或细胞、组织或器官维持在受控温度下的第二容器。

或者，试剂盒可以包含用于接收细胞、组织或器官和细胞保存介质的无菌容器，所述无菌容器含有低氧和/或高二氧化碳氛围，所述无菌容器任选地用细胞保存介质预填充。

根据另一方面，本发明还涉及本发明的试剂盒用于实施本发明的方法(即用于在重度低温下保存动物细胞)的用途。