[发明专利]具有改变的PAM特异性的工程化CRISPR‑Cas9核酸酶

权利要求书

1.一种分离的化脓链球菌Cas9(SpCas9)蛋白，其在以下位置中的一个或多个处具有突变：G1104、S1109、L1111、D1135、S1136、G1218、N1317、R1335、T1337。

2.如权利要求1所述的分离的蛋白，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少80％一致的序列。

3.如权利要求1所述的分离的蛋白，其包含以下突变中的一个或多个：G1104K；S1109T；L1111H；D1135V；D1135E；D1135N；D1335Y；S1136N；G1218R；N1317K；R1335E；R1335Q；以及T1337R。

4.如权利要求1-3所述的分离的蛋白，其包含以下突变：D1135E(D1135E变体)；

D1135V/R1335Q/T1337R(VQR变体)；D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(VRQR变体)；D1135E/R1335Q/T1337R(EQR变体)；D1135N/G1218R/R1335Q/T1337R(NRQR变体)；D1135Y/G1218R/R1335Q/T1337R(YRQR变体)；G1104K/D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(KVRQR变体)；S1109T/D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(TVRQR变体)；L1111H/D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(HVRQR变体)；D1135V/S1136N/G1218R/R1335Q/T1337R(VNRQR变体)；D1135V/G1218R/N1317K/R1335Q/T1337R(VRKQR变体)；或D1135V/G1218R/R1335E/T1337R(VRER变体)。

5.如权利要求1所述的分离的蛋白，其还包含降低核酸酶活性的选自下组的一个或多个突变，该组由以下各项组成：在D10、E762、D839、H983或D986处的突变；以及在H840或N863处的突变。

6.如权利要求5所述的分离的蛋白，其中这些突变是：

(i)D10A或D10N，和

(ii)H840A、H840N、或H840Y。

7.一种在以下位置中的一个或多个处具有突变的分离的金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)蛋白：E782、N968和/或R1015。

8.如权利要求7所述的分离的蛋白，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少80％一致的序列。

9.如权利要求7所述的分离的蛋白，其包含以下突变中的一个或多个：R1015Q、R1015H、E782K、N968K、E735K、K929R、A1021T、K1044N、E782K/N968K/R1015H(KKH变体)；E782K/K929R/R1015H(KRH变体)；或E782K/K929R/N968K/R1015H(KRKH变体)。

10.如权利要求7所述的分离的蛋白，其还包含降低核酸酶活性的选自下组的一个或多个突变，该组由以下各项组成：在D10、D556、H557和/或N580处的突变。

11.如权利要求7所述的分离的蛋白，其中这些突变是D10A、D556A、H557A、N580A，例如D10A/H557A和/或D10A/D556A/H557A/N580A。

12.一种包含经任选的介入接头与异源功能结构域融合的如权利要求1-11所述的分离的蛋白的融合蛋白，其中该接头不干扰该融合蛋白的活性。

13.如权利要求12所述的融合蛋白，其中该异源功能结构域是转录激活结构域。

14.如权利要求12所述的融合蛋白，其中该转录激活结构域来自VP64或NF-κB p65。

15.如权利要求12所述的融合蛋白，其中该异源功能结构域是转录沉默子或转录阻遏结构域。

16.如权利要求15所述的融合蛋白，其中该转录阻遏结构域是克鲁贝尔相关盒(KRAB)结构域、ERF阻遏因子结构域(ERD)或mSin3A相互作用结构域(SID)。