[发明专利]ETV2及其用途

说明书

本文描述了产生表达人ETV2基因的嵌合非人动物的方法，包括：a)生成ETV2无效的非动物细胞，其中非人ETV2基因的两个拷贝都携带防止在所述非人动物中产生功能性ETV2蛋白的突变；b)通过体细胞核转移创建ETV2无效的非人胚泡，所述体细胞核转移包括将a)的所述ETV2无效的非人动物细胞的核融合到去核的非人卵母细胞中，并激活所述卵母细胞分裂，从而形成ETV2无效的非人胚泡；c)将人干细胞引入b)的ETV2无效的非人胚泡；以及d)将来自c)的所述胚泡植入假孕替代非人动物中，以生成表达人ETV2的嵌合非人动物。

优先权声明

本申请要求2015年3月3日提交的美国临时专利申请第62/127,330号的优先权权益，据此要求该临时申请的优先权权益，并通过引用将该临时申请全部并入本文。

序列表

此文件通过引用在本文并入了电子序列表文本文件，该文本文件通过EFS-Web以电子格式提交。该文本文件称为“1552048.txt，”，12,288个字节，并且创制于2016年3月1日。

背景技术

血液是人体的主要器官。其由细胞和血浆组成。细胞部分包括红细胞、白细胞和血小板。血浆成分由水和溶解的化合物，尤其是如蛋白、糖或电解质组成。

血液的形成开始于原肠胚形成的过程中。第一造血谱系出现于卵黄囊的血岛中。造血前体细胞的分化受遗传程序的调节。最近证明，该遗传程序的关键因子是基因Ets变异基因2(Etv2)(Stem cells.2012August；30(8)：1611-1623.doi：10.1002/stem.1131)。小鼠Etv2基因的除去导致卵黄囊丧失造血谱系和内皮谱系。Etv2基因在Etv2-突变体中的强制过表达恢复了血液谱系和内皮谱系。Genesis 2013Jul：51(7)：471-480.Doi：10.1002/dvg.22396。

血液障碍可影响红细胞的产生(即贫血)、白细胞的增殖(即白血病)或血小板的凝固(即凝血病)。捐赠的血液用于治疗这些不同的障碍。红细胞用于治疗患有与镰状细胞贫血病、地中海贫血、再生障碍性贫血、白血病或癌症有关的慢性贫血的患者。血小板用于控制经历外科手术的患者的出血。目前，人血液的唯一来源就是人供体。

发明概述

本发明基于猪中Etv2基因缺失导致在造血内皮(hematoendothelial)发育前期步骤造血谱系和内皮谱系的消融这一新发现。本发明生成了缺乏猪Etv2基因(并因此缺乏猪血管和血液)的猪胚泡。通过将人干细胞如Etv2基因阳性iPS细胞注射到突变的猪(缺乏Etv2)胚泡，本发明生成了衍生自人干细胞如iPS细胞的人或人源化血液和血管。每年，超过300,000名美国人经历冠状动脉旁路移植术，并且会从使用这类工程化的冠状血管中获益。

本文描述了ETV2敲除猪或其他动物如牛或山羊的开发，作为用于产生临床应用的个性化人/人源化血液和血管的宿主。生成血液的祖细胞还生成代表血管内衬的内皮。在缺少内皮的情况下，没有血管，并且发育的胚胎是不能存活的。除了充当用于治疗心血管疾病和造血疾病的人/人源化组织的新来源之外，人源化猪还会充当研究人谱系再生和对药物应答的大型动物模型。发现Etv2作为传统心血管转录因子和造血内皮转录因子以及信号传导级联的靶标，已证明Etv2调节造血内皮谱系的特化和分化。此外，已经注意到Etv2变异小鼠胚胎是不能存活的，并且缺少内皮/血管谱系和造血谱系。利用基因编辑技术，进一步确立ETV2变异猪胚胎缺乏造血谱系和内皮谱系。基于这些结果，Etv2是发育过程中造血内皮谱系的主调节剂。本文描述了人源化遗传修饰生物替代物的工程化。

一实施方案提供了非人动物细胞或胚泡，其中基因组在ETV2基因的两个等位基因中都携带突变，从而使得非人动物细胞或胚泡缺乏功能性ETV2蛋白。在一实施方案中，突变是缺失ETV2基因。在另一实施方案中，非人动物细胞或胚泡是猪、牛、马或山羊。