[发明专利]用于制备跨膜pH梯度囊泡的方法

说明书

本发明涉及用于制备跨膜pH梯度囊泡的方法。该方法的特征在于以下步骤：a)在摩尔渗透压浓度不高于200mOsm/l的水性介质中制备由至少一种基质物质制成的囊泡，其中所述基质物质选自两亲性脂质和两亲性嵌段共聚物；b)将所述囊泡转移到摩尔渗透压浓度比步骤a)中水性介质的摩尔渗透压浓度高至少200mOsm/l的碱性或酸性缓冲液中，以向所述囊泡施加渗透冲击并获得缓冲液填充囊泡；以及c)通过添加中和溶液来稀释包含所述缓冲液填充囊泡的所述水性介质与所述碱性或酸性缓冲液的混合物，以获得悬浮在悬浮缓冲液中的跨膜pH梯度囊泡，其中所述悬浮缓冲液与所述碱性或酸性缓冲液的pH值不同。

本发明涉及用于制备跨膜pH梯度囊泡的方法，涉及跨膜pH梯度囊 泡，以及涉及这样的跨膜pH梯度囊泡的用途。

最近，具有远程负载能力(例如跨膜pH梯度脂质体)的囊泡(例如 脂质体)的静脉内(Forster等，Biomaterials 2012；33：3578-3585)或腹 膜内(Forster等，Sci TranslMed 2014；6：258ra141)施用已被描述为治 疗药物过量和内源代谢物中毒(例如高血氨症)的有吸引力的方法。这些 脂质体具有内部隔室，其包含酸性或碱性缓冲剂，并且允许通过在内部隔 室与外部环境之间存在pH梯度来以其电离态隔离有毒化合物。

根据现有技术，通常如下制备跨膜pH梯度脂质体：在酸性或碱性介 质中水合，然后滴定(Nichols和Deamer Biochimica et Biophysica Acta 1976；455：269-271)，通过凝胶过滤(Mayer等，Biochimica et Biophysica Acta 1985；816：294-302)或透析(Forster等，Biomaterials 2012； 33：3578-3585)进行介质交换，然后快速用于封装药物。

根据现有技术，在包含封装的化合物的最终制剂上进行对这些囊泡的 灭菌。然而，如果要长时间维持跨膜pH梯度(如在生物解毒剂的情况下) 和/或如果在高温下对脂质体进行灭菌，则这种方法并不合适。实际上， 由于化学物质跨脂质体膜扩散和/或脂双层的脂质组分(主要是磷脂)的 降解，跨膜pH梯度随着时间降低。此外，在碱性或酸性介质中，可加速 脂质体组分(主要是磷脂)的化学降解，如果灭菌过程涉及加热(如高压 釜(autoclave))的话尤其如此。

Stevens和Lee(Stevens和Lee Anticancer Res.2003；23：439-442)所 描述的对该问题的解决方案在于制备无菌冻干脂质体，然后将其悬浮在酸 性或碱性介质中，然后中和以产生跨膜pH梯度。该方法涉及冻干步骤， 这通常意味着在无菌条件下制备脂质体，该过程可能昂贵且难以控制，当 待冻干大体积时尤其如此。因此从工业角度来看该方法并不理想。此外， 如果使用大量的脂质，如在生物解毒应用(例如腹膜透析)的情况下，冻 干脂质体以可再生的方式快速重悬是有问题的。

US 5,393,530A描述了远程负载脂质体囊泡的方法。因此，通过将低 摩尔渗透压浓度(osmolarity)(渗透浓度)的脂质体溶液与待封装物质混 合来实现跨膜负载。然后，将混合物加热到高于构成脂质体囊泡之脂质的 膜脂转变温度(T_c)的温度，以实现膜去稳定化并将物质并入囊泡内部。

Bertrand等(ACS nano 2010；4：7552-7558)描述了用于形成跨膜pH 梯度脂质体的方法，其中在第一步中将酸性缓冲液封装在脂质体中。在第 二步中，交换脂质体周围的外部缓冲液以在所形成的脂质体的内部和外部 之间建立跨膜pH梯度。

本发明的一个目的是提供可以以简单的方式生产稳定的跨膜pH梯度 囊泡而无现有技术的前述限制的制备方法。特别地，所述制备方法的工业 应用是可能的。

该目的通过具有权利要求1特征的用于制备跨膜pH梯度囊泡的方法 实现。