[发明专利]使用细胞分裂基因座控制细胞增殖的工具和方法

权利要求书

1.一种分离的基因修饰的动物细胞，包括至少一种选自CDK1、TOP2A、CENPA、BIRC5和EEF2的内源基因的基因修饰，其中所述基因修饰包括编码阴性选择标记的DNA序列，所述阴性选择标记的DNA序列转录连接至编码至少一种所述基因的DNA序列，使得阴性选择标记和至少一种所述基因共表达。

2.如权利要求1所述的分离的基因修饰的动物细胞，其中所述阴性选择标记包括单纯疱疹病毒-胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、羧基酯酶或iCasp9。

3.如权利要求2所述的分离的基因修饰的动物细胞，其中所述基因是CDK1和所述阴性选择标记是单纯疱疹病毒-胸苷激酶。

4.如权利要求1所述的分离的基因修饰的动物细胞，其中至少一种所述基因的基因修饰通过包括编码所述阴性选择标记的DNA序列的DNA载体产生。

5.如权利要求1所述的分离的基因修饰的动物细胞，其中所述基因修饰是纯合的、杂合的、半合子的或复合杂合的。

6.如权利要求1 所述的分离的基因修饰的动物细胞，其中两种或更多种所述内源基因包括所述基因修饰。

7.如权利要求6所述的分离的基因修饰的动物细胞，其中所述两种或更多种内源基因是CDK1和TOP2A或CDK1和EEF2。

8.如权利要求1所述的分离的基因修饰的动物细胞，其中：

a) 所述动物细胞是选自人类、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猫、狗、奶牛、马、鹿、麋鹿、野牛、公牛、骆驼、美洲驼、兔、猪、山羊、绵羊和非人灵长类动物细胞的哺乳动物细胞或是禽类细胞；或者

b) 所述动物细胞是或衍生自多能干细胞、多潜能细胞或单能祖细胞或是终末分化细胞。

9.一种组合物，其包含如权利要求 1至 8中任一项所述的分离的基因修饰的动物细胞群体。

10.权利要求1-8中任一项的分离的遗传修饰的动物细胞，其用于治疗受试者。

11.一种控制权利要求1-8中任一项的分离的基因修饰的动物细胞的增殖的离体方法，包括：

a）通过在没有阴性选择标记的诱导物的情况下维持细胞来允许细胞增殖；或

b）通过将细胞暴露于阴性选择标记的诱导物来消融或抑制细胞增殖。

12.如权利要求11所述的离体方法，其中：

i）阴性选择标记包括单纯疱疹病毒-胸苷激酶和诱导物包括更昔洛韦；

ii）阴性选择标记包括胞嘧啶脱氨酶和诱导物包括5-氟胞嘧啶；

iii）阴性选择标记包括羧基酯酶和诱导物包括伊立替康；或

iv）阴性选择标记包括iCasp9和诱导物包括AP1903。

13.一种制备其中增殖可被控制的基因修饰的动物细胞的离体方法，包括将编码阴性选择标记的DNA序列插入动物细胞中至少一种选自CDK1、TOP2A、CENPA、BIRC5和EEF2的内源基因的基因座，使得编码阴性选择标记的DNA序列与编码至少一种所述内源基因的DNA序列转录连接，从而使阴性选择标记和至少一种所述基因共表达。

14.如权利要求13所述的离体方法，其中所述阴性选择标记包括单纯疱疹病毒-胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、羧基酯酶或iCasp9。

15.如权利要求14所述的离体方法，其中所述基因是CDK1并且所述阴性选择标记是单纯疱疹病毒-胸苷激酶。

16.如权利要求13所述的离体方法，其中至少一种所述基因的基因修饰包括用包含编码所述阴性选择标记的DNA序列的DNA载体对至少一种所述基因的每一种进行靶向修饰。