[发明专利]包含至少两种衣壳化的非病毒RNA的逆转录病毒颗粒

说明书

本发明涉及用于将非病毒RNA转移进靶细胞中的逆转录病毒系统，且更具体地涉及能够递送多种RNA的逆转录病毒颗粒。更具体地，它涉及包含从Gag多蛋白衍生出的蛋白、包膜蛋白、任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA的逆转录病毒颗粒，所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列，每种衣壳化序列被引入从Gag多蛋白衍生出的蛋白中和/或整合酶中的结合结构域识别。

本发明涉及用于将非病毒RNA转移进靶细胞中的逆转录病毒系统，且更具体地涉及能够递送多种RNA的逆转录病毒颗粒。本发明还涉及包含这些逆转录病毒颗粒的组合物、用于生产它们的试剂盒、与其有关的制备方法、以及所述颗粒和组合物的用途。

将多种RNA引入靶细胞中是研究和开发中的一项重大挑战，如在基因治疗中。

从病毒衍生出的载体的应用已经变成基因转移的一项重要方法。目前，病毒载体分成两大类：

- 整合载体，其将自身整合进接受者基因组中，和

- 非整合载体，其经常形成染色体外遗传元件。

整合载体诸如γ-逆转录病毒载体（RV）和慢病毒载体（LV）会稳定地整合。非整合载体诸如腺病毒（ADV）载体和腺伴随病毒（AAV）载体从快速分裂的细胞中迅速地消除。一些影响特定载体的选择的因素包括它的衣壳化能力、它的宿主或靶细胞范围、它的基因表达谱、它的转导效率和它的引起免疫应答的能力，如果需要重复转导的话，这是特别有问题的。

某些应用需要使用非整合载体，诸如在基因治疗中或在众多体外、离体和体内应用中。作为例子，可以举例以下：

● 诱导专门细胞重新程序化为多能细胞，以及诱导干细胞或多能细胞分化成专门细胞，

● 同时在靶细胞中表达抗原或蛋白（无论是否有毒），

● 表达基因工程系统例如诸如CRE或TALEN蛋白或CRISPR系统，或任意其它需要蛋白或RNA表达的系统。

一种用于将RNA引入靶细胞中的方式采用以属于逆转录病毒科（Retroviridae）（也通过名称反转录病毒科或RNA病毒来命名）的病毒为基础的病毒载体。实际上，在它的复制周期过程中，逆转录病毒科的病毒具有将它的由RNA构成的基因组转化成双链DNA的能力，所述双链DNA将整合进靶细胞的基因组中。该逆转录病毒科的具体例子是γ-逆转录病毒和慢病毒。

逆转录病毒的复制周期包括通过结合膜受体而识别靶细胞（或宿主）的第一阶段。该识别阶段导致在与膜融合以后逆转录病毒进入宿主细胞中。逆转录病毒RNA然后通过逆转录病毒编码的逆转录酶复制成双链DNA，然后整合进宿主细胞的基因组中。该病毒基因组然后象宿主细胞的所有其它基因一样被宿主细胞转录。该基因组编码能够产生其它病毒的所有蛋白和序列。

更具体地，三种基因是所有逆转录病毒共有的：gag、pol和env。

Gag是编码多蛋白的基因，通过切割从该多蛋白衍生出的蛋白是在复制后参与病毒组装的结构蛋白。这些结构蛋白更具体地是基质蛋白（MA）、衣壳蛋白（CA）和核衣壳蛋白（NC）。

Pol是编码整合酶、逆转录酶和蛋白酶的基因。

Env是编码包膜糖蛋白的基因。