[发明专利]苯丙素类和苯丙素类衍生物的生物合成

说明书

本文中提供了用于产生苯丙素类化合物和苯丙素类衍生物化合物的重组宿主和方法。发现，来自杀鲑气单胞菌A449(Aeromonas salmonicida A449)的酪氨酸解氨酶提高香豆酸产生。

发明背景

技术领域

本文中公开的发明总体上涉及遗传工程领域。特别地，本文中公开的发明提供了用于生物合成产生苯丙素类(phenylpropanoid)和苯丙素类衍生物(例如查耳酮和茋)的方法。

相关技术说明

苯丙素类是植物中由酚类氨基酸前体生物合成产生的多样的酚类化合物家族。苯丙素类及其衍生物具有期望的应用，例如在食品和卫生保健工业中具有期望的应用。

一种示例性苯丙素类衍生物是柚皮素，该化合物也是下游苯丙素类衍生物产生中的中间体。柚皮素具有以下化学结构：

柚皮素在植物中天然产生，并且还在遗传改造成具有类黄酮生物合成途径组分的细胞中生物合成(参见例如，Koopman等，(2012)Microbial Cell Factories 2012，11：155)。例如，将改造成产生香豆酰CoA的细胞进一步改造成具有表达将香豆酰CoA转化成柚皮素的蛋白质的重组基因。

另一种示例性苯丙素类衍生物是茋类白藜芦醇，其也是产生其他下游苯丙素类衍生物中的中间体。白藜芦醇具有以下化学结构：

白藜芦醇也使用香豆酰CoA前体分子产生。

一般来说，茋(包括白藜芦醇)和查耳酮在植物和酵母中通过苯丙素类途径产生，如图1中所示的反应举例说明的并且如U.S.2008/0286844中所述的，其通过引用整体并入本文。

在酵母中，起始代谢物是丙二酰CoA和苯丙氨酸或酪氨酸。氨基酸L-苯丙氨酸通过L-苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)的非氧化脱氨被转化成反式-肉桂酸。接着，反式-肉桂酸通过肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)、细胞色素P450单加氧酶并联合NADPH：细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase，CPR)在对位被羟基化成4-香豆酸(4-羟基肉桂酸)。或者，氨基酸L-酪氨酸通过酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia lyase，TAL)直接转化成4-香豆酸。来自任一途径的4-香豆酸随后通过4-香豆酸-CoA连接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)的作用被激活成4-香豆酰CoA。在苯丙素类途径中，4-香豆酰CoA代表由其衍生苯丙素类衍生物(包括查耳酮和茋)的关键分支点。茋通过也称为白藜芦醇合酶(resveratrol synthase，RS)的茋合酶(stilbenesynthase，STS)合成，所述酶催化4-香豆酰CoA的苯丙烷单元与丙二酰CoA缩合，使得形成白藜芦醇。反之，查耳酮通过4-香豆酰CoA的苯丙烷单元与丙二酰CoA的缩合和查耳酮合酶(chalcone synthase，CHS)合成，使得形成四羟基查耳酮。

当前产生柚皮素、白藜芦醇和其他苯丙素类衍生物的方法由于竞争苯丙素类(例如香豆酰CoA)作为底物的途径而受到限制。例如，改造成产生柚皮素的细胞还通过未知的机制产生根皮酸(参见例如，Koopman等，(2012)Microbial Cell Factories 2012，11：155)。根皮酸是苯丙素类途径的一种副产物。其是一种二氢-苯丙素类，由苯丙素类(例如，对香豆酰CoA)转化成二氢苯丙素类(例如，对二氢香豆酰CoA)。然而，负责产生二氢苯丙素类(并降低柚皮素产生)的酶目前尚不知晓。