[发明专利]经过修饰的T细胞及其制备和使用方法

权利要求书

1.一种经过修饰的原代人类T细胞，其包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：

(a)第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；

(b)第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性；

(c)(i)第三基因组修饰，其中染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，和/或

(c)(ii)第四基因组修饰，其中染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性；和

(d)第五基因组修饰，其中染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性；和

各细胞任选地包含：

(e)(i)至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位；或编码所述至少一种嵌合抗原受体的外源核酸，和/或

(e)(ii)至少一种外源蛋白，所述外源蛋白调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应；或编码所述蛋白的外源核酸。

2.一种经过修饰的原代人类T细胞，其包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：

(a)第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，所述第一连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的5’端上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏所述基因组DNA的第一连接延伸段的经过修饰的CTLA4基因，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或

(b)第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，所述第二连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏所述基因组DNA的第二连接延伸段的经过修饰的PD1基因，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。

3.一种经过修饰的原代人类T细胞，其包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：

(a)第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性，其中所述基因组DNA的第一连接延伸段已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸和第一对具有选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失；和/或

(b)第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性，其中所述基因组DNA的第二连接延伸段已经通过使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第二对具有选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失。

4.如权利要求3所述的细胞，其中所述第一对核糖核酸包含SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72，并且其中所述第二对核糖核酸包含SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421。