[发明专利]用于基因测序和其它应用的条形编码系统及方法

说明书

相关申请

本申请要求由Weitz等于2015年4月17日提交的标题为“Barcoding Systems and Methods for Gene Sequencing and Other Applications”的美国临时专利申请序列号62/149,361的权益，所述美国临时专利申请通过引用并入本文。

政府资助

本发明是在国家科学基金会授予的第DMR-1310266号和第DMR-1420570号拨款以及由国立卫生研究院授予的第P01HL120839号拨款下借助政府资助完成的。政府对本发明享有一定的权利。

领域

本发明总体涉及微流体和标记的核酸。

背景

随着高通量测序技术的发展，研究人员已经产生了大量的基因组和表观遗传学数据。已从患者中提取疾病相关基因，并将序列信息用于临床诊断和治疗。

高通量测序通常依赖于进行大量的个体反应，得到核酸序列的数百个碱基。例如，Illumina HiSeq测序仪(HiSeq 2500Rapid Run Mode)的一次“运行”需要27个小时，产生约12亿个配对的末端读数(反应)，给出约150个碱基的序列。对于许多实验来说，这种大量的序列信息大大超过单个样本所需要的信息。

因此，至少就此问题而言，所期望的是在测序之前标记(“条形编码”)样本的能力，使得可在单次测序运行中分析许多样本。一个实例是单细胞转录分析。研究人员可能想分析数百个细胞的数百个基因的表达水平。如果在测序之前遗传标记(条形化)来自单个细胞的RNA，则这可在单个HiSeq运行中进行。

概述

本发明总体上涉及微流体和标记的核酸。在一些情况下，本发明的主题涉及针对特定问题的相关产品、替代解决方案和/或一个或多个系统和/或制品的多个不同用途。

一方面，本发明总体上涉及方法。在一组实施方案中，所述方法包括提供包含颗粒的多个液滴，使得至少约90％的液滴包含一个颗粒或不包含颗粒(所述颗粒包含寡核苷酸)，并将核酸序列附接至所述寡核苷酸。在一些情况下，所述寡核苷酸包含条形码序列，第一条形码选自预先确定的第一条形码池，第二条形码选自预先确定的第二条形码池，例如，使得基本上每个颗粒包含可区分的条形码序列。

根据另一组实施方案，所述方法包括提供包含颗粒的多个液滴，使得至少约90％的液滴包含一个颗粒或不包含颗粒，所述颗粒包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含条形码序列第一条形码和第二条形码(第一条形码选自预先确定的第一条形码池，第二条形码选自预先确定的第二条形码池)，以及衔接子序列，使得基本上每个所述颗粒包含可区分的条形码序列；将衔接子序列暴露于包含互补衔接子序列和引物的序列；将引物暴露于包含引物的靶标的核酸序列；并进行扩增以产生包含第一条形码、第二条形码和核酸序列的寡核苷酸。

在另一组实施方案中，所述方法包括提供附接有寡核苷酸的多个颗粒，所述寡核苷酸包含选自预先确定的第一条形码池的第一条形码、选自预先确定的第二条形码池的第二条形码，以及衔接子序列；并通过该衔接子序列将核酸序列附接至寡核苷酸。

根据另一组实施方案，所述方法包括将多个细胞和多个颗粒包封在多个微流体液滴内，基本上每个颗粒包含寡核苷酸和与其共价键合的核酸序列，使得至少10,000个的多个液滴的每个液滴含有与所述多个液滴的其它液滴中所含的寡核苷酸可区分的一个或多个寡核苷酸；裂解所述液滴内的至少一些细胞以从所述细胞释放核酸，其中所述核酸序列包含能够与至少一些所述释放的核酸相互作用的部分；以及选择性扩增液滴内所释放核酸的部分以产生包含扩增部分和寡核苷酸的序列。

在另一组实施方案中，该方法包括提供至少10,000个含有细胞的多个微流体液滴，至少约90％的所述多个液滴含有一个细胞或不含细胞；裂解所述多个微流体液滴内的细胞以从细胞释放核酸；以及在与寡核苷酸结合的液滴内产生选择性扩增的核酸。在一些情况下，对于至少约90％的液滴，液滴内的寡核苷酸可与多个液滴中的其它液滴内的寡核苷酸区分开。

在另一组实施方案中，所述方法包括提供至少约10,000个含有细胞的多个微流体液滴，使得不超过10％的液滴含有两个或更多个细胞，裂解所述多个液滴内的细胞以从细胞释放核酸，以及选择性扩增液滴内所释放核酸的部分以产生包含扩增部分和液滴特异性条形码的序列。