[发明专利]鉴定用于凝血障碍的诊断和风险分层的标记蛋白的方法

说明书

本发明涉及鉴定用于以凝血障碍的诊断和风险分层为目的的标记蛋白的方法。

本发明涉及鉴定用于以凝血障碍的诊断和风险分层为目的的标记 蛋白的方法。

与做出临床决定的必要性相关，特别是在急救医学医学中，以适宜 疗法为目的，需要进行凝血障碍的早期诊断和区分。

通过不同物质(尤其是胶原蛋白、凝血酶、免疫复合物)的影响， 凝血细胞释放储存在颗粒中的血小板因子(脱粒)，其主要起到激活凝 血或止血的内源系统形成血栓的作用。然而，凝血细胞的激活，特别是 由于遗传或疾病原因会被破坏。这通常伴随着严重心血管效应或次生效 应的升高风险。因此有必要的是测定凝血细胞的活度和可激活性(AuA)。这是与凝血细胞中蛋白的磷酸化程度相联系的，例如VASP并且受制于激 酶活性。

凝血细胞的AuA的个体测定旨在允许准确分类患者到风险分组中， 进行适宜的个体化疗法(制剂、给药剂量、疗程、组合)并对其管理。

在现有技术中，凝血细胞的AuA被分析于大量的凝血细胞功能性测 试中，其中用激动剂或剪切力激活凝血细胞，并例如测定聚集，以获得 关于凝血细胞可激活性(同义于应答)的结论，例如在用药物如氯吡格 雷治疗之后。

这些功能性测试主要包括三个主类型：(i)基于聚集的测试，诸如 LTA(光透射集合度测试)，(ii)依赖于剪切力的测试，和(iii)通流细 胞计数。通常发现，由于大量的不同方法和极少的测试标准化(以及前 分析法)，一方面不同测试之间的相关性极低，且另一方面相关于药物 应答和治疗管理的预测的各种测试的准确性在实践中是不令人满意的(Krisha et al.,Circulation 2012,1288-1303)。借助于基因分类 的治疗管理也被讨论，以致于这两种方法当前被质疑(Krisha et al., Circulation 2012,1288-1303)。通过磷酸特异性抗体确定VASP磷酸 化程度的所述VASP分析(用于证明依赖于环-核苷的蛋白激酶的活性的 测试系统，DE 100 29 210 A1)，是当前从极少血量中检测凝血细胞- 功能性状态/活化状态的金标准。

看起来，如在大多数测试中所使用的单一激酶底物或参数的测量不 足以明确测定凝血细胞的AuA，主要是对于凝血细胞而言已知的是在各 种激活以及抑制信号途径的关联下。

因此已知诊断方法的缺陷是，不能足够成功地早期且完全发现风险 患者，并且因此不能足够成功地进行风险分层和疗法控制。本发明的一 项基本任务在于，开发一种将凝血障碍进行风险分层的方法，其允许更 好地发现风险患者以及在进一步的任务中鉴定相应的标记蛋白。

此外的缺陷是，在现有技术中多数标记蛋白不能实现足够的敏感性 和/或特异性。

因此本发明的任务是提供一种鉴定用于以凝血障碍的诊断和风险 分层为目的的标记蛋白的方法，以及测定凝血细胞的活度和可激活性的 方法，其由患者(同义词：被测试者)血液进行。

所述任务通过根据权利要求1的方法完成，其具有以下步骤：

i.)提供包含凝血细胞的血液、全血、血清或血浆，

ii.)分出至少两种等份，

iii.)A.添加凝血细胞激活剂到至少一个第一种等份中且

B.添加凝血细胞抑制剂到至少一个第二种等份中，且一次或多次重复各 添加，且任选地

C.添加凝血细胞激活剂和添加凝血细胞抑制剂到至少一个第三种等份中 或相反进行，且任选地一次或多次重复各添加，

iv.)细胞特别是源自iii.)A.、B.和C.各等份中的凝血细胞的裂解，

v.)提取蛋白且借助于蛋白酶消化成肽，

vi.)富集和分离经磷酸化的肽

vii.)借助定量质谱法分析并评价，