[发明专利]制造适于向体细胞分化诱导的干细胞克隆的方法

说明书

本发明提供一种方法，该方法是制造干细胞克隆的方法，包括：(i)将与向体细胞的分化诱导相关的外源性基因导入到干细胞的工序；(ii)将导入有外源性基因的干细胞分化诱导为上述体细胞的工序；(iii)将分化诱导而成的体细胞进行脱分化的工序；以及(iv)从通过工序(iii)形成的干细胞集落，分离出上述外源性基因整合到染色体而成的干细胞的工序。

技术领域

本发明涉及使利用了体细胞的重编程并由各种集团构成的干细胞或体细胞进行来源于单一细胞的细胞集团化，即克隆化的方法等。

背景技术

在细胞株研发中，克隆是重要的工序，以往，该克隆利用有限稀释法来进行。

虽然通过向细胞导入外源性基因来进行使细胞向期望的细胞类型变化(专利文献1、非专利文献1和非专利文献2)，但由于导入的外源性基因的拷贝数和/或染色体上的导入部位等不同，所以得到的细胞不一样。因此，虽然考虑通过有限稀释法来进行克隆，但未必所有细胞均能够适用有限稀释法。

另外，导入外源性基因而得到的细胞即使进行相同的方法，再次得到期望的细胞的概率也低，因此在需要对该细胞进行同源重组等基因操作的情况下，能够进行这样操作的细胞类型受到限制。

近年来，提出了由使保有期望的TCR型的T淋巴细胞重编程而得到的iPS细胞再次诱导为T淋巴细胞的补充疗法(专利文献2或非专利文献3)，但这并不是针对克隆或基因操作。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2014/148646

专利文献2:WO2011/096482

非专利文献

非专利文献1：Nakamura S等，Cell Stem Cell.14：535-548,2014

非专利文献2：Tanaka A等PLoS One.8：e61540,2013

非专利文献3：Nishimura T等，Cell Stem Cell.12(1)：114-126,2013

发明内容

技术问题

本发明的目的在于，使由各种集团构成的干细胞或体细胞进行来源于单一细胞的细胞集团化，即进行克隆化。

技术方案

本发明人等发现，从经过一次或多次脱分化而制备出的干细胞集落分离出与体细胞的分化诱导相关的基因整合到染色体而成的干细胞，结果分离出的干细胞适于向体细胞分化诱导，从而完成了本发明。

即，本发明提供以下的发明。

一种制造[A1]干细胞克隆的方法，包括：

(i)将与向体细胞的分化诱导相关的外源性基因导入到干细胞的工序，

(ii)将导入有上述外源性基因的干细胞分化诱导为上述体细胞的工序，

(iii)将分化诱导而成的体细胞进行脱分化的工序，以及

(iv)从通过工序(iii)形成的干细胞集落分离出上述外源性基因整合到染色体而成的干细胞的工序。

[A2]在[A1]记载的方法中，分离出的干细胞克隆的向体细胞的分化诱导效率比克隆化前的干细胞的向体细胞的分化诱导效率高。

[A3]在[A1]或[A2]记载的方法中，上述体细胞为造血前体细胞、巨核前体细胞、成红血细胞、神经细胞、神经干细胞、神经嵴细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、软骨细胞，肝细胞或黑素细胞。