[发明专利]一种能够增强mRNA稳定性和可译性的通用核酸药物载体

说明书

本发明提供了一种通过分子生物学技术所构建的核酸载体pVec。pVec含有CMV增强子/启动子、T7启动子、5’非翻译区(UTR)、多克隆位点、3’UTR、poly A(120A)‑TTATT、BGH poly(A)信号、卡那霉素抗性基因和pUC起点等。因此，pVec可用作DNA疫苗或治疗药物以及mRNA疫苗或mRNA治疗药物的载体。pVec中的5’UTR、3’UTR和poly A(120A)‑TTATT能够被分别添加到体外转录mRNA的5’和3’端，并能稳定所转录的mRNA。此外，本发明还提供了构建的pVec‑GM‑CSF、pVec‑hIL‑12和pVAX1‑hIL‑12，来进一步评价pVec。

描述

发明背景

本发明涉及生物技术领域内的核酸药物。尤其是，本发明涉及一种增强mRNA稳定性和可译性的通用核酸药物载体。

核酸药物系应用DNA和RNA作为疫苗或治疗药物在临床上用于预防和治疗疾病。

多年来，RNA被认为是不稳定的，且易于降解。因此，核酸药物，尤其是核酸疫苗的研究，大多数是基于DNA疫苗。DNA疫苗是含有外源抗原基因序列的质粒DNA。它被递送到宿主体中并通过细胞膜和核膜进入细胞核。在细胞核内，被递送的外源抗原基因DNA被转录成mRNA，然后被转运到细胞质内，并翻译成蛋白质。表达的蛋白能诱导抗原免疫应答，达到预防和治疗癌症、病毒性疾病等目的。常用的DNA疫苗载体包括pcDNA3.1和pVAX1。其中，pcDNA3.1被美国食品药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)禁止用于人类临床，这是因为pcDNA3.1含有氨苄青霉素抗性基因。由于DNA疫苗不容易通过细胞膜和核膜，只有少数DNA分子可以进入细胞核内，使得难以刺激机体并进一步引起强烈的免疫应答。因此，尚未有DNA疫苗被批准用于人类临床。目前，所应用的电穿孔方法大大提高了DNA疫苗的转染效率和免疫效果，但仍然存在质粒DNA是否整合到宿主细胞基因组中的担忧。

近年来，质粒载体的改进提高了体外转录mRNA的稳定性，使我们的注意力转向mRNA药物，特别是mRNA疫苗。在pGEM4Z/A64载体的基础上，构建了pGEM4Z/GFP/A64和pGEM4Z/OVA/A64，并将其作为产生体外转录mRNA的模板。所产生的mRNA通过鼻内途径接种以诱导抗肿瘤免疫[Phua KK，et al.Sci Rep.2014；4：5128]。应用pcDNA3.1-64A和pSP73-Sph/A64，分别构建几种含有肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens，TAAs)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白单克隆抗体(glucocorticord-induced TNFR-related proteinmonoclonal antibody，GITR mAb)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4单克隆抗体(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4 mAb，CTLA-4 mAb)的载体，并将其用于产生相应的体外转录mRNA，后者被电穿孔至树突细胞(DC)。获得的DC-mRNA疫苗用于增强抗肿瘤免疫[Pruitt SK，et al.Eur J Immunol.2011；41(12)：3553-63]。pSpjC-βglacZβga_n和pT7TSβggfpβga_n被分别构建，导致LacZ基因和绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)基因两侧分别为5’-非翻译区(untranslated region，UTR)和3’-非翻译区(from xenopus laevisβ-globin)[Hoerr I，et al.Eur J Immunol.2000；30(1)：1-7]。应用由V.F.I.Van Tendeloo提供的pSP64-Poly(A)-EGFP-2，分别构建含有肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens，TAAs)如粘蛋白1(mucin 1，MUC1)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、人表皮生长因子受体2(human epidermal growthfactor receptor 2，Her-2/neu)、端粒酶(telomerase)、存活素(survivin)、黑色素瘤相关抗原1(melanoma-associated antigen 1，MAGE-1)的载体，将其作为模板用于产生体外转录的mRNA，进一步用于抗肿瘤免疫[Rittig SM，et al.Mol Ther.2011；19(5)：990-9]。此外，5’UTR被人工合成，且被用于增加mRNA的稳定性[Andreas Thess.US 20150050302A1.Artificial nucleic acid molecules comprising a 5’top utr]。应用pST1-Sp-MITD-2hBgUTR-A120，分别构建几种含有多个突变主要组织相容性复合物(MHC)II类表位序列的载体，并作为模板产生体外转录的mRNA，然后将其接种到体内以产生个性化抗癌免疫[Kreiter S，et al.Nature 2015；520(7549)：692-6]。