[发明专利]新型CRISPR酶以及系统

权利要求书

1.一种工程化的、非天然存在的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关（Cas）（CRISPR-Cas）系统，包含

a) 一种或多种指导RNA，该指导RNA包含连接至同向重复序列的指导序列，其中该指导序列能够与靶序列杂交，或者一种或多种编码该一种或多种指导RNA的核苷酸序列，以及

b)V-A型CRISPR-Cas效应蛋白或者编码该效应蛋白的一种或多种核苷酸序列，其中所述效应蛋白包含RuvC结构域，但不包含HNH结构域，并且能在没有任何tracrRNA的条件下与指导RNA形成CRISPR复合物；

其中该一种或多种指导序列与所述靶序列杂交，所述靶序列是原型间隔区相邻基序（PAM）的3’，并且所述指导RNA与该效应蛋白形成复合物。

2.一种包含一种或多种载体的工程化的、非天然存在的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关（Cas）（CRISPR-Cas）载体系统，包含

a) 可操作地连接至一种或多种核苷酸序列的第一调节元件，该一种或多种核苷酸序列编码一种或多种指导RNA，该指导RNA包含连接至同向重复序列的指导序列，其中该指导序列能够与靶序列杂交，

b)可操作地连接至编码V-A型CRISPR-Cas效应蛋白的核苷酸序列的第二调节元件，其中所述效应蛋白包含RuvC结构域，但不包含HNH结构域，并且能在没有任何tracrRNA的条件下与指导RNA形成CRISPR复合物；

其中组分(a) 和 (b) 位于该系统的相同或不同的载体上，

其中当转录时，该一种或多种指导序列与所述靶序列杂交，所述靶序列是原型间隔区相邻基序（PAM）的3’，并且所述指导RNA与该效应蛋白形成复合物。

3.如权利要求1或2所述的系统，其中该靶序列是在细胞内。

4.如权利要求3所述的系统，其中该细胞是真核细胞。

5.如权利要求1或2所述的系统，其中当转录时，该一种或多种指导序列与该靶序列杂交并且该指导RNA与该效应蛋白形成一种复合物，该复合物引起该靶序列远 端切割。

6.如权利要求5所述的系统，其中所述切割生成具有4或5-nt 5’突出端的交错双链断裂。

7.如权利要求1或2所述的系统，其中该PAM包含5’ T-富集基序。

8.如权利要求1或2所述的系统，其中该效应蛋白是来源于选自下组的细菌种类，该组由以下各项组成：土拉热弗朗西丝菌1、土拉热弗朗西丝菌新杀手亚种、易北普雷沃菌、毛螺旋菌科细菌MC2017 1、解朊丁酸弧菌、佩莱格里尼菌科细菌GW2011_GWA2_33_10、Parcubacteria细菌GW2011_GWC2_44_17、密斯氏菌属某种SCADC、氨基酸球菌属某种BV3L6、毛螺旋菌科细菌MA2020、候选白蚁甲烷枝原体、挑剔真细菌、牛莫拉氏菌237、稻田钩端螺旋体、毛螺旋菌科细菌ND2006、狗口腔卟啉单胞菌3、解糖胨普雷沃菌和猕猴卟啉单胞菌。

9.如权利要求8所述的系统，其中该PAM序列是TTN，其中N是A/C/G或T并且该效应蛋白是FnCpf1或者其中该PAM序列是TTTV，其中V是A/C或G并且该效应蛋白是PaCpf1p、LbCpf1或AsCpf1。

10.如权利要求1或2所述的系统，其中该效应蛋白包含一个或多个核定位信号。

11.如权利要求1或2所述的系统，其中编码该效应蛋白的这些核酸序列被密码子优化用于在真核细胞中表达。

12.如权利要求1或2所述的系统，其中组分 (a) 和 (b) 或这些核苷酸序列是在一种载体上。