[发明专利]对CAS内切核酸酶系统、PAM序列和指导RNA元件的快速表征

权利要求书

1.一种用于鉴定前间区序列邻近基序(PAM)序列的方法，所述方法包括：

a)提供质粒DNA文库，其中所述质粒DNA中的每一个都包含在靶序列邻近处整合的随机化前间区序列邻近基序序列，所述靶序列可以被指导RNA/Cas内切核酸酶复合物识别；

b)向所述质粒文库提供指导RNA和Cas内切核酸酶蛋白，其中所述指导RNA和Cas内切核酸酶蛋白可以形成能够将双链断裂引入所述靶序列的复合物，从而产生切割靶标文库；

c)将衔接子连接至(b)中的切割靶标文库，允许对所述切割靶标文库进行扩增；

d)扩增所述切割靶标文库，使得含有所述随机化PAM序列的切割产物被富集，从而产生富集的PAM在侧边的靶标的文库；

e)对(a)中的文库和(d)中的富集的PAM在侧边的靶标的文库进行测序，并鉴定在所述质粒DNA的任一条链上与(b)中的切割靶标邻近的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列代表推定的前间区序列邻近基序序列；并且，

f)相对于(a)中的质粒DNA文库，确定所述推定的前间区序列邻近基序序列内每个核苷酸的富集倍数。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述随机化PAM序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个随机的核苷酸。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述靶序列是至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。

4.如权利要求1所述的方法，其中将所述Cas内切核酸酶蛋白作为纯化的蛋白质、包含所述Cas内切核酸酶的细胞裂解物、包含所述Cas内切核酸酶的细胞裂解物的稀释液、体外翻译混合物或体外翻译混合物的稀释液来提供。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述Cas内切核酸酶蛋白选自由以下组成的组：Cas9蛋白、Cpf1蛋白、C2c1蛋白、C2c2蛋白、C2c3蛋白、Cas3、Cas3-HD、Cas5、Cas7、Cas8、Cas10、或这些的复合物。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述Cas内切核酸酶是选自由以下组成的组的Cas9内切核酸酶：SEQ ID NO：81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91和140。

7.一种重组DNA，其包含至少一个与靶序列邻近的随机化前间区序列邻近基序(PAM)序列，所述靶序列可以被指导RNA/Cas内切核酸酶复合物识别。

8.一种用于鉴定生物体的tracrRNA的方法，所述方法包括：

a)提供包含非天然存在的嵌合crRNA的第一单指导RNA候选者，所述crRNA包含能够与细胞的基因组中的靶序列杂交的可变靶向结构域，所述第一单指导RNA候选者连接至代表在所述生物体中天然存在的候选者tracrRNA的正义表达的第一核苷酸序列；

b)提供包含非天然存在的嵌合crRNA的第二单指导RNA候选者，所述crRNA包含能够与所述细胞的基因组中的靶序列杂交的可变靶向结构域，所述第二单指导RNA候选者连接至代表在所述生物体中天然存在的候选者tracrRNA的正义表达的第二核苷酸序列；

c)向所述第一和第二单指导RNA候选者提供Cas内切核酸酶蛋白，其中所述Cas内切核酸酶蛋白可以与所述第一单指导RNA候选者或所述第二单指导RNA候选者形成复合物，其中所述复合物能够将双链断裂引入所述靶序列中；并且，

d)鉴定所述第一或第二指导RNA候选者及其tracrRNA组分，所述tracrRNA组分与(c)中的Cas内切核酸酶复合并导致所述细胞的基因组中的所述靶序列的切割。

9.一种用于鉴定生物体的tracrRNA的方法，所述方法包括：

a)鉴定所述生物体的基因组基因座中的CRISPR阵列重复序列；

b)将(a)中的CRISPR阵列重复序列与(a)中的基因组基因座的序列进行比对，并鉴定编码tracrRNA的反重复序列；并且，

c)确定所述tracrRNA的转录方向。