[发明专利]肝脏干细胞的衍生和成熟肝细胞类型及其用途

权利要求书

1.一种肝脏干细胞，其包括以下特征：

(i)表达蛋白质标志物SOX9、HNF4α、HNF3β和EPCAM；

(ii)表达高于背景表达或阴性对照细胞的表达至少2倍，但不超过5倍的KRT19蛋白，

(iii)不表达可检测水平的KRT7和AFP；和

(iv)不具有极化细胞表型。

2.权利要求1的肝脏干细胞，其进一步表达1、2、3、4或5种选自CD24、PROM1、FOXA3、FOXQ1和ECAD的蛋白质标志物。

3.权利要求1的肝脏干细胞，其中所述干细胞的特征在长期培养中保持，并且在培养物中19代后包括正常的核型。

4.权利要求1至3中任一项的肝脏干细胞，其中所述肝脏干细胞是哺乳动物肝脏干细胞。

5.权利要求4的肝脏干细胞，其中所述肝脏干细胞是人肝脏干细胞。

6.权利要求4的肝脏干细胞，其中所述肝脏干细胞是小鼠肝脏干细胞。

7.权利要求4的肝脏干细胞，其中所述肝脏干细胞是胎儿肝脏干细胞。

8.权利要求1至3中任一项的肝脏干细胞，其中所述肝脏干细胞分离自健康受试者。

9.权利要求1至3中任一项的肝脏干细胞，其中所述肝脏干细胞分离自患有肝病的受试者，其中所述肝病选自代谢性疾病、自身免疫性疾病、传染病、药物诱导的急性和慢性肝衰竭，以及肝癌。

10.一种用于培养权利要求1-9中任一项所述的肝脏干细胞的细胞培养系统，其中所述系统包括：

a)多种可溶性试剂，其包括：

至少一种生长因子，

经典WNT途径的增强剂，

干细胞分化抑制剂；和

b)能够提供结构和营养支持的细胞支持物。

11.权利要求10的细胞培养系统，其中所述系统增强干细胞增殖和/或防止干细胞分化成成熟肝细胞。

12.权利要求10的细胞培养系统，其中所述系统是无骨形态发生蛋白抑制剂和/或无肝细胞生长因子和/或无成纤维细胞生长因子系统。

13.权利要求10的细胞培养系统，其中所述细胞支持物将肝细胞保持在粘附层中。

14.权利要求10至13中任一项的细胞培养系统，其中所述肝脏干细胞特征在于具有至少一种选自以下的特征：

a.在细胞支持物上培养时，所述肝脏干细胞的形状是小而圆的，并且群集在一起形成圆盘样结构，

b.所述肝脏干细胞表达高于背景表达或阴性对照细胞的表达至少2倍，但不超过5倍的KRT19，

c.所述肝脏干细胞对于标志物上皮钙粘蛋白、上皮细胞粘附分子、肝细胞核因子4α和性别决定区Y-盒9是阳性的；

d.其中低于15％的肝脏干细胞表达Krt7；

e.至少80％的肝脏干细胞表达用于肝细胞谱系分化的转录因子；

f.所述肝脏干细胞包括双能性祖细胞/干细胞；和

g.所述肝脏干细胞能够发育成具有至少四个主要细胞色素P450功能的成熟成体肝细胞。

15.权利要求14的细胞培养系统，其中低于5％的肝脏干细胞表达Krt7。

16.权利要求14的细胞培养系统，其中所述用于肝细胞谱系分化的转录因子是NHF4a。

17.权利要求10的细胞培养系统，其中所述细胞支持物包括饲养细胞。