[发明专利]用于细胞培养的可消化底物

说明书

相关申请的交叉引用

本申请依据35 U.S.C.§119要求于2015年9月25日提交的序列号为62/233,044的美国临时申请以及2015年6月8日提交的序列号为62/172,299的美国临时申请的优先权权益，本申请以其内容为基础，并通过引用将其全文纳入本文。本申请涉及共同转让的第8,4044,85号和第8,426,176号美国专利以及涉及共同未决及共同转让的第WO2014/209865号和第WO2014/0120616号国际申请，本申请以其内容为基础，并通过引用将其全文纳入本文。

背景

技术领域

本公开一般涉及制造可消化的底物的方法，更具体而言，涉及可以用于例如分离蛋白质、细胞和病毒以及还可以用于诊断应用和细胞培养的透明可消化微载体。

背景技术

在位于平坦表面上进行的细胞培养中，粘附细胞可达到高度汇合并因此通过细胞间接触抑制来限制细胞扩增，与这样的细胞培养不同的是，具有高表面积/体积比的球形微载体为有效的细胞培养放大或扩增提供了有吸引力的平台，其中收获的细胞或条件培养基可以是所需的产品。

细胞培养依靠的是充分的氧化以及向细胞供应营养物质。相关的挑战包括搅拌微载体以提供所需的氧气和营养物质而不产生足以破坏正在生长的细胞的水动应力。常规来说，使用叶轮进行搅拌。

另一个挑战涉及从细胞或条件培养基中分离出微载体。酶处理可以用于例如收获粘附细胞，尽管酶的加入可破坏细胞。例如，蛋白水解酶可以非选择性地清洁细胞表面受体。

一旦培养的细胞达到汇合，胰蛋白酶常用于使粘附细胞与基质分离。作为一个实例，在使用涂覆有胶原的微载体珠粒培养和收获锚着依存性细胞的方法中，一旦完成生长，则胶原可以消化掉微载体。然而，由于胰蛋白酶的蛋白水解活性，细胞表面蛋白常被切割，这可能导致不期望的细胞功能破坏。认为胰蛋白酶诱导了蛋白质组改变和细胞生理学改变。胰蛋白酶化可以诱导下调生长相关及代谢相关的蛋白质表达和上调凋亡相关的蛋白质表达，提示用于细胞传代培养的胰蛋白酶对细胞生理学可具有不利影响。

作为蛋白酶有害影响的另一个实例，还已知用蛋白酶(如胰蛋白酶)处理细胞使得从癌细胞中除去了抗原，因此可能使其不能用于开发抗癌治疗的疫苗。因此，不使用胰蛋白酶或在不存在蛋白水解酶(例如胰蛋白酶)的情况下收获细胞是非常需要的。

鉴于上述，有利的是，提供低成本、有效的方法来合成细胞生长表面，所述细胞生长表面包括微载体，尤其是具有受控粒径、组成、均匀性和晶体结构，以及具有支持细胞附着和/或生长，能够使非蛋白水解细胞分离和收获的表面化学的微载体。

发明内容

根据本公开的实施方式，细胞培养制品包括含有聚半乳糖醛酸化合物的底物，所述聚半乳糖醛酸化合物选自果胶酸或其盐以及酯化度为1至40摩尔％的部分酯化的果胶酸或其盐中的至少一种。聚半乳糖醛酸化合物与二价阳离子交联。底物中的二价阳离子浓度在0.5至2g/l底物的范围内。

制造细胞培养制品的方法包括将水胶体溶液分配(即，逐滴)到凝胶浴中。水胶体溶液包含聚半乳糖醛酸(PGA)化合物，所述聚半乳糖醛酸化合物(PGA)选自果胶酸或其盐和酯化度为1至40摩尔％的部分酯化的果胶酸或其盐中的至少一种。凝胶浴包含二价金属盐。

培养细胞的方法包括使细胞与具有上述细胞培养制品的细胞培养基接触以及在培养基中培养细胞。收获培养的细胞的方法包括在上述细胞培养表面上培养细胞，以及使培养的细胞与果胶酶和螯合剂的混合物接触以从制品中分离出细胞。

在实施方式中，微载体是透明的，能够进行细胞观察的，并且适于在化学成分明确的培养基或有血清培养基中进行大规模细胞繁殖。

PGA底物的制备与现有的能够制备具有均匀尺寸分布的微载体的高通量制造工艺相兼容。均匀的尺寸分布免除了额外的筛分步骤的需要，筛分步骤是劳动密集型的、耗时的，并且要求另外的仪器及大量的水和有机溶剂。本公开的合成不是基于乳化方法，因此不需要使用表面活性剂或者作为分散介质的大量有机溶剂。另外，所述方法使用水溶形式的钙，因此，能够制备允许容易地观察细胞的具有光滑表面的均匀且透明的PGA底物。所述方法是环境友好型的，并且比基于乳化或内部凝胶化的方法更加经济。

可消化的细胞培养制品公开于共同转让的国际公布号WO2014/209865中，其内容通过引用的方式全文纳入本文。