[发明专利]用于抗体碎片的改进的复性方法

说明书

本发明提供雷珠单抗的复性方法，其中将重质链和/或轻质链的雷珠单抗的增溶溶液用复性缓冲液在合适的条件下处理，包括pH，温度和培养期，并且该pH和温度变化以合适的间隔进行的，来获得高品质和量的复性的蛋白质。

发明领域

本发明涉及生产抗体碎片例如雷珠单抗的方法。更具体地，本发明提供从细菌细胞中所形成的包涵体来回收复性的雷珠单抗的方法。

发明背景

抗体碎片小于常规的抗体，并且通常缺乏糖基化，其允许它们在原核表达系统中生产(Kurucz I等人，Mol Immunol.199532(17-18)：1443-52.)。虽然这些较小抗体碎片的基因结构是容易制造的，但是复性碎片的表达变得更困难，这归因于非本来结构。但是，它们可以容易地作为包涵体(IB)在细菌细胞中制造，限定它可以成功复性。但是，IB形成和不溶性蛋白质的复性已经是完全利用大肠杆菌细胞质表达技术的主要障碍(TsutomuArakawa等人，抗体2014，3：232-241)。

雷珠单抗(Lucentis)是一种设计用于眼内的重组体人类化IgG1k同型体单克隆抗体碎片。雷珠单抗结合到和抑制了人类血管内皮生长因子A(VEGF-A)的生物活性。雷珠单抗的分子量是大约48千道尔顿，因为它缺乏Fc区域，并且仅仅由Fab组成，所以可以通过细菌表达系统，优选在大肠杆菌中表达它。Fab碎片对应于该抗体分子的两个相同的臂，其包含完全的轻质链(LC)和与之配对的重质链(HC)的VH和CH1阈。当Fab的LC和HC阈是在细菌系统中，在相同的宿主或者不同的宿主中过表达时，它们形成了称作包涵体的不溶性聚集体。

包涵体主要包含不溶性形式的无活性错复性蛋白质，并且将它转化成活性天然证实总是具有一定的挑战，并且已经报告了几个方法来回收复性的抗体碎片。(TesturoFujii等人，J.Biochem.2007141：699–707；Jin-Liang Xing等人，World J Gastroenterol200410(14)：2029-2033)。但是它们的一些不能以工业规模来成规模的，并且另一些产生了非常低复性的蛋白质。此外，研究还尝试了不同的复性技术(Eliana De Bernardez Clark，Current Opinion in Biotechnology 1998，9：157-163)。

此外，本领域仍然需要提供一种从细菌细胞中形成包涵体中回收高品质和量的复性的蛋白质例如雷珠单抗的方法。所以本发明提供一种从包涵体中回收复性的雷珠单抗的有效方法。

发明内容

在一种实施方案中，本发明提供一种从包涵体中回收复性的雷珠单抗的方法，该方法包含在合适的pH，温度和培养期条件下进行的增溶和复性步骤。

在一种实施方案，本发明提供在包括pH，温度和培养期的合适的条件下，用复性缓冲液处理重质链和/或轻质链雷珠单抗的增溶溶液的方法，其中该pH和温度变化是以合适的间隔进行来获得高品质和量的复性的蛋白质。

在一种实施方案中，本发明提供一种回收复性的雷珠单抗的方法，该方法包含步骤：

a)从细菌宿主细胞中分离轻质链和/或重质链雷珠单抗；

b)将所述的轻质链和/或重质链的雷珠单抗在包含促溶剂和/或还原剂的第一缓冲溶液中，在pH大约9增溶；

c)将所述增溶轻质链和重质链雷珠单抗在第二缓冲液溶液中，在具有高pH和低温度的合适的条件下复性，直到第一培养期，然后将该合适的条件改变到低pH和高温度，直到第二培养期，其中该pH和温度变化是在第一和第二培养期之间进行的，来获得复性的雷珠单抗；

d)回收所述的复性的雷珠单抗。

在一种实施方案中，本发明提供一种回收复性的雷珠单抗的方法，其包含步骤：

a)从细菌宿主细胞中分离轻质链和/或重质链雷珠单抗；