[发明专利]在自动化反应盒中DNA甲基化的整合的纯化和测量以及突变和/或mRNA表达水平的共同测量

权利要求书

1.一种测定核酸的甲基化状态的方法，所述方法包括：

i)使包含核酸的生物样品与包含第一柱或滤器的第一基质材料接触，其中所述基质材料结合和/或过滤所述样品中的核酸，从而纯化DNA；

ii)从所述第一基质材料上洗脱结合的DNA并使DNA变性以产生洗脱的变性DNA；

iii)在亚硫酸氢盐试剂的存在下加热洗脱的DNA以产生脱氨基的核酸；

iv)使所述脱氨基的核酸与包含第二柱的第二基质材料接触以使所述脱氨基的核酸与所述第二基质材料结合；

v)将结合的脱氨基的核酸脱磺酸基和/或通过将所述脱氨基的核酸与碱性溶液接触来同时使所述核酸洗脱并脱磺酸基以产生转化的(例如亚硫酸氢盐转化的)核酸；

vi)从所述第二基质材料上洗脱所述亚硫酸氢盐转化的核酸；和

vii)在所述转化的核酸上进行甲基化特异性PCR和/或核酸测序和/或高分辨率熔解分析(HRM)以测定所述核酸的甲基化，其中至少步骤iv)至vi)在单个反应盒中进行。

2.权利要求1的方法，其中：

至少步骤iv)至vi)在单个反应盒中进行；或

至少步骤iii)至vi)在单个反应盒中进行；或

至少步骤ii)至vi)在单个反应盒中进行；或

至少步骤i)至vi)在单个反应盒中进行。

3.权利要求1-2中任一项的方法，其中在相同的反应盒中进行步骤vii。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中：

所述第一基质材料和所述第二基质材料是形成相同柱的相同材料；或

所述第一基质材料和所述第二基质材料形成不同的柱。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中当进行所述甲基化特异性PCR时，是在所述盒中进行。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中当进行所述核酸测序时，是在所述盒中或与所述盒偶联的装置中进行。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述盒包括含有所述第一基质材料的柱、样品接收室、温度控制的通道或室、多个包含试剂和/或缓冲液的室，并且其中在使用时所述室中的至少一个包含脱磺酸基/洗脱缓冲液，并且其中所述盒任选地包括含有所述第二基质材料的第二柱。

8.权利要求7的方法，其中，在使用时，所述室中的至少一个包含提供亚硫酸氢盐离子的试剂。

9.权利要求7-8中任一项的方法，其中所述第二柱不存在。

10.权利要求7-9中任一项的方法，其中所述温度控制的通道或室包括热循环通道或室。

11.权利要求7-10中任一项的方法，其中所述盒包括含有一种或多种试剂的一个或多个室，所述试剂选自甲基化特异性PCR引物、甲基化特异性PCR探针、PCR酶和PCR反应缓冲液。

12.权利要求11的方法，其中所述盒包括：

含有一种或多种引物和探针的一个或多个室，所述引物和探针用于检测亚硫酸氢盐转化的DNA的正向链的甲基化；和/或

含有一种或多种引物和探针的一个或多个室，所述引物和探针用于检测亚硫酸氢盐转化的DNA的反向链的甲基化。

13.权利要求7-12中任一项的方法，其中所述样品接收室、所述柱、所述多个室、和当存在时，所述温度控制的通道或室和/或热循环通道或室，选择性地处于流体连通中。

14.权利要求13的方法，其中所述样品接收室、所述柱、所述多个室、和当存在时，所述热循环通道或室，通过微流体通道和阀选择性地处于流体连通中。

15.权利要求13的方法，其中所述样品接收室、所述柱、所述多个室、和当存在时，所述热循环通道或室或进入所述热循环通道或室的端口，排列在中央阀的周围并且选择性地处于与所述中央阀中的通道的流体连通中，其中配置所述中央阀以适应柱塞，所述柱塞能够将流体引入或引出与所述中央阀处于流体连通的室。