[发明专利]用于加速基因组编辑的单倍体诱导系

权利要求书

1.一种生成加倍的单倍体植物细胞的方法，所述植物细胞在选择的DNA序列处或其附近包含突变，所述方法包括：

（a）用编码稀切核酸内切酶的核酸转化单倍体诱导系以生成用于加速基因组编辑的单倍体诱导系HILAGE贮存系，其具有稳定整合到其中的核酸，其中所述编码稀切核酸内切酶的核酸与在受精后的至少第一次和第二次细胞分裂期间在植物胚中表达的启动子操作性地连接，并且其中所述稀切核酸内切酶靶向所述选择的DNA序列；

（b）将HILAGE贮存系与靶向的系杂交以生成包含所述稳定整合的核酸的F₁合子；

（c）培养所述F₁合子，使得（i）所述稀切核酸内切酶被表达，并在所述选择的DNA序列处或其附近切割染色体DNA，其中切割后所述染色体DNA的修复导致所述突变，和（ii）发生基因组消除，使得来自包含稳定整合到其中的核酸的HILAGE贮存系的染色体被消除，产生单倍体细胞，所述单倍体细胞不包含编码稀切核酸内切酶的核酸；并且

（d）在所述单倍体细胞中诱导染色体加倍以产生含有所述突变的加倍的单倍体植物细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞来自玉米，小麦，大麦，黑小麦，拟南芥，燕麦，青椒，番茄，马铃薯，大豆或荠蓝。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述稀切核酸内切酶是转录激活物样效应物核酸内切酶，CRISPR/Cas基核酸酶，锌指核酸酶或大范围核酸酶。

4.如权利要求1所述的方法，其中启动子是花椰菜花叶病毒加倍增强35S启动子，玉米ZmUb1启动子，或水稻APX，OsCc1，EIF5，R1G1B，PGD1，Act1或SCP1启动子。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述修复包括同源重组。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述突变包括一个或多个核苷酸取代，添加，或缺失。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述突变包括插入转基因DNA序列。

8.一种生成加倍的单倍体植物细胞的方法，所述植物细胞在选择的DNA序列处或其附近包含突变，所述方法包括：

（a）用编码稀切核酸内切酶的核酸转化植物细胞系以生成具有稳定整合到其中的核酸的转基因植物细胞系，其中所述编码稀切核酸内切酶的核酸与受精后至少第一次和第二次细胞分裂期间在植物胚中表达的启动子操作性地连接，并且其中所述稀切核酸内切酶靶向所述选择的DNA序列；

（b）将所述转基因植物细胞系与单倍体诱导系杂交以生成HILAGE贮存系，所述HILAGE贮存系对于所述编码稀切核酸内切酶的核酸纯合并且其大部分DNA来自所述单倍体诱导系，其中所述HILAGE贮存系能在杂交后诱导单倍体；

（c）将所述HILAGE贮存系与靶向的系杂交以生成包含所述稳定整合的核酸的F₁合子；

（d）培养所述F₁合子，使得（i）所述稀切核酸内切酶被表达，并在所述选择的DNA序列处或其附近切割染色体DNA，其中切割后所述染色体DNA的修复导致所述突变，和（ii）发生基因组消除，使得来自包含稳定整合到其中的核酸的HILAGE贮存系的染色体被消除，产生单倍体细胞，所述单倍体细胞不包含编码稀切核酸内切酶的核酸；并且

（e）在所述单倍体细胞中诱导染色体加倍以产生含有所述突变的加倍的单倍体植物细胞。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述植物细胞来自玉米，小麦，大麦，黑小麦，拟南芥，燕麦，青椒，番茄，马铃薯，大豆或荠蓝。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述稀切核酸内切酶是TALE核酸内切酶，CRISPR/Cas基核酸酶，ZFN，或大范围核酸酶。