[发明专利]高通量核酸测序系统中用于颜色探测的系统和方法

说明书

一种测序仪器光学系统具有：组合光源，具有多束共线的激发光束，这些激发光束具有各自不同的激发波长；测序表面，具有DNA模板和碱基标记，这些碱基标记被配置成，当其被一束或多束激发光束激发时，以各自不同的发光波长发出相应的发射光；彩色摄像机，配置为用以探测每个碱基标记的发射光；第一光路，配置成将这些共线的激发光束从组合光源引导至测序表面；以及第二光路，配置成将发射光从测序表面引导至彩色摄像机。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年9月1日提交的美国第62/212,820号临时申请的权益，在此针对所有目的而通过援引整体纳入该临时申请的内容。

技术领域

概括而言，本发明涉及用于探测与在合成测序(sequencing-by-synthese)或其它测序过程期间使用的碱基关联的荧光染料或其它发光标记的仪器。

背景技术

DNA测序过程用于确定DNA分子中的碱基对的顺序。该技术具有多种多样的用途，如确定DNA分子的一致性或者确定DNA分子是否包括特别的特征(例如，表明先天条件的特征)，等等。可使用多种技术确定DNA序列。例如，在典型的合成测序(SBS)过程中，可使用专门设计的核苷酸和DNA聚合酶来以受控方式读取表面束缚的单链DNA模板的序列。该过程使用标记(也称为探测物或标签)来识别构成DNA分子的特定的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)。其它测序技术可使用天然的核苷酸和/或聚合酶或标记的寡核苷酸以及链接酶(ligation enzymen)来确定核酸序列。

以其最基本的意义，SBS过程通过一次使DNA模板分子的长度延伸一个碱基，并且记录所增加的碱基的序列来进行操作。更具体而言，该过程通过使DNA模板延伸一个碱基，并以光学方式检查(“读取”)生成的分子来确定在DNA模板位置是否存在标记(或者存在什么种类的标记)。标记的存在表示与该特定标记关联的碱基已被加入到DNA模板。随后，该过程被重复多次以确定构成DNA模板的碱基对序列。为了提高处理速度且使该过程更具实用性，通常期望处理数百万个DNA模板，每个DNA模板可包括更大的DNA分子的片段。例如，可将数百万个DNA模板置于测序表面上的有序的位置或随机位置(“模板位置”)，并且一起被处理。每个DNA模板自身可包括单个分子或多个本质上相同的分子。在处理了DNA模板以确定它们的序列之后，可将各个的序列彼此相比较并进行核对以确定初始完成的DNA分子的性质。

依靠以光学方式检查碱基标记的传统的SBS方法和其它方法必须以非常小尺度的DNA模板以及低光照强度的碱基标记来操作。典型的碱基标记包括荧光分子，其具有当被外部“激发”光源激发时发光的荧光复合物。所发出的光的波长取决于特定的荧光团。由于光子的能量损失(一种被称为“斯托克斯位移”的现象)，所发出的光的平均波长通常稍微大于激发光的平均波长。所述光的密度非常低，这在一定程度上可以通过在原位放大每个DNA模板，以在每个模板点处聚集多个相同的碱基标记来解决。然而，即使借助这种放大，仍需要采取措施以将来自背景噪声的核苷酸标记以及可能处于附近其它标记的核苷酸标记产生的信号仔细地地区分开。

在一些情况下，这种延伸和读取的过程是通过仅呈现单种碱基(例如，腺嘌呤)以在每个延伸步骤中接合DNA模板，执行读取以探测哪个DNA模板已被延伸，并随后对其余的每种碱基(鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)分别重复相同过程而连续地执行。这种连续过程使得在读取步骤期间一个碱基会被错读为另一个的可能性最小化，因为在每个延伸和读取循环期间仅能增加一种碱基。然而，该过程是耗时的，因为其需要大量处理步骤：四个完整的延伸循环以及四个完整的读取循环，以使所有DNA模板延长一单个碱基对。

在其它情况下，能够通过在每个延伸循环期间将一些或所有碱基呈现到DNA模板而并行地执行此延伸步骤。此方法加速了该过程，因为每个DNA模板理论上将在单个延伸循环期间被延伸。然而，该过程可能仍然需要连续的四个不同的读取步骤，以精确地识别与每种碱基关联的标记。该过程还可能与依次处理相比要求更加高的光学性能，因为一些碱基标记具有相似的照明波长(如绿色和黄色，或者红色或暗红色)，这就可能使得这些标记的区别更困难。