[发明专利]冷冻保存有蹄类动物胚胎

说明书

描述了用于移植到受体雌性的冷冻保存有蹄动物胚胎的技术。

交叉引用

本申请要求2015年7月14日提交的美国临时申请序列号62/192,544的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。

背景技术

体外胚胎生产是牛育种的主要组成部分。通常生产的胚胎多于植入的胚胎。尽管在玻璃化体外胚胎生产(IVP)的胚胎移植(ET)中，最近已经实现超过30％的受孕率，但玻璃化后的这些胚胎的复苏的复杂过程仍然是该技术的商业应用的障碍。牛胚胎冷冻保存需要新的、有效的方案。

发明内容

本发明提供了用于冷冻保存的牛胚胎和/或使用冷冻保存的牛胚胎实现受精的技术。本发明还提供了冷冻保存的胚胎、这些冷冻保存的胚胎的种群以及用于生产和/或储存它们的系统等。

此外，本发明还包括利用用于冷冻保存的胚胎的胚胎移植的某些可用技术，特别是用于复苏(例如解冻、植入等)冷冻保存的胚胎的问题源的识别。例如，本发明认识到根据许多标准技术复苏有活性的冷冻保存的胚胎所需的人员和时间引起关于其商业适用性的顾虑。

此外，本发明内容还认识到，相对于使用冷冻保存的胚胎的大多数标准技术，需要实现改进的受孕率的冷冻保存的胚胎的移植技术，应当理解的是，这样的标准技术通常实现低于使用新鲜胚胎所实现的受孕率。除此之外，本发明内容提供了实现冷冻保存的胚胎的期望(例如，约10％或更多)受孕率的技术。

在一些实施例中，本发明提供了包括以下步骤的方法，例如：获得体外生产的(IVP)有蹄类动物胚胎；冷冻保存胚胎；并且将胚胎移植到受体有蹄类动物中，进行冷冻保存和移植，从而实现至少约10％的妊娠率。

在一些实施例中，获得一个或多个体外生产的胚胎包括以下步骤，例如：从雌性中回收一种或多种卵母细胞；体外成熟一个或多个卵母细胞；用精液或一个或多个分离的精子细胞使一个或多个成熟的卵母细胞受精，从而产生一个或多个受精卵；并且剥露和孵育一个或多个受精卵。在一些实施例中，使用的精液是性别分离的。在一些实施例中，精液不是性别分离的。

在一些实施例中，体外成熟卵母细胞包括例如：在至少一个选自由温度、气体的存在或量、湿度、pH，渗透压及其组合组成的组的条件的生理相关范围内孵育卵母细胞。在一些实施例中，气体的存在或量选自由O₂和CO₂组成的组。在一些实施例中，体外成熟卵母细胞的步骤包括：在35-40℃下、3-9％CO₂和饱和湿度孵育卵母细胞。在一些实施例中，剥露和孵育受精卵的步骤包括在35-40℃、含5％CO₂的空气和饱和湿度下孵育受精卵。在一些实施例中，剥露和孵育受精卵的步骤还包括以5％O₂孵育受精卵。

在一些实施例中，冷冻保存胚胎包含以下步骤，例如：在包含冷冻保护剂的溶液中孵育胚胎；并将胚胎浸入液氮中。在一些实施例中，冷冻保存胚胎的步骤包括以下步骤：在约10℃至约38℃范围内的第一温度下，在由1.0-4M乙二醇组成的冷冻溶液中孵育胚胎5-30分钟；将胚胎装载到容器中，其中气泡在渗稀释培养基中将胚胎从包含乙二醇的解冻溶液分离；将胚胎暴露于约-2至约-10℃的温度范围内约1分钟至约60分钟范围的时间段；以约每分钟-0.2至大约-0.8℃的范围内的速度降温，直到达到约-30至约-36℃范围内的第二温度；并将胚胎浸入液氮中储存。在一些实施例中，乙二醇以约0.2至约1.3摩尔的范围内的最终浓度呈现。

在一些实施例中，将胚胎冷冻保存以直接移植到受体雌性中。

在一些实施例中，移植胚胎包括以下步骤：在矿物油作用下，在使用牛血清白蛋白(BSA)补充的培养基中孵育胚胎约5至约9天范围的时间段；并将胚胎移植到受体有蹄类动物中。在一些实施例中，培养基选自由C4培养基、SOF培养基、SOFaa培养基及其组合组成的组。在一些实施例中，培养基补充有血清、胎牛血清、胎牛血清、牛血清白蛋白和/或一种或多种氨基酸中的一种或多种。