[发明专利]利用旋转式搅拌培养法的血小板的制造方法

说明书

本发明提供一种方法，其是血小板的制造方法，包括在培养容器内的培养液中培养巨核细胞的工序，在该培养工序中，利用搅拌子对培养液进行搅拌。

技术领域

本发明涉及利用旋转式搅拌培养的血小板的制造方法。

背景技术

对于手术时或受伤时的大量出血、或呈现伴随着抗癌剂治疗后的血小板减少的出血趋势的患者，以该症状的治疗和预防作为目的服用血小板制剂。目前，血小板制剂的制造依赖于健康志愿者进行的献血。然而，在日本，由于人口构成而导致献血者人数减少，推测在2027年存在约100万人程度的献血缺口。因此，作为本发明的技术领域的目的之一，可举出血小板的稳定供给。

另外，以往的血小板制剂由于因细菌污染导致的风险高，所以有可能在血小板制剂的移植后发生重大的感染症。因此，在临床实践中，总是寻求更安全的血小板制剂。为了满足其需求，目前已经开发了从在体外培养出的巨核细胞生成血小板的方法。

以往，从培养细胞生成血小板在使用了培养皿的静置培养体系中进行(WO2014/100779A1，Qiang Feng等,Stem Cell Reports)。然而，静置培养体系非常耗工，不适合大量培养。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:国际公开第2014/1007791号公报

非专利文献

非专利文献1:Qiang Feng等,Stem Cell Reports 3 1-15(2014)

发明内容

技术问题

本发明的发明人等通过使用利用了摇瓶的振摇培养体系、即振摇培养容器本身的培养方法，成功地生成出具有高生理活性的血小板。然而发现在摇瓶培养体系中，随着培养基量的规模增大，发生血小板(CD41a+CD42b+)生成量和血小板的生理活性(PAC1结合性，P-选择素(P-selectin)阳性)的降低。

此外，发现在摇瓶培养体系中，发生认为由脱落(shedding)反应等导致的血小板的劣化反应(CD42b阳性率的降低)。除此之外，也已知大量包含了不适于向生物体的移植的异常的血小板(膜联蛋白V阳性的血小板)。

因此，本发明的课题在于提供一种以大规模的量生成能够向生物体移植的高品质的血小板的方法。

技术方案

本发明的发明人等为了解决上述课题反复进行了研究，其结果发现，不通过振摇培养容器，而是通过在利用配置于培养容器内的搅拌子将培养液沿旋转方向搅拌的同时培养巨核细胞，能够提高血小板的生成效率和生理活性，并且能够将血小板的劣化抑制得低，减少异常血小板。此外，研究了利用搅拌培养进行培养时的细胞密度、搅拌转速、其他的条件而完成本发明。

即，本发明是一种方法，其是血小板的制造方法，包括在培养容器内的培养液中培养巨核细胞的工序，在上述培养工序中，利用搅拌子搅拌上述培养液。

另外，在本发明的血小板的制造方法中，还优选上述搅拌子为叶片状。

另外，在本发明的血小板的制造方法中，还优选上述培养容器是封闭型生物反应器。

另外，在本发明的血小板的制造方法中，还优选以转速50rpm以上使搅拌子旋转。

另外，在本发明的血小板的制造方法中，还优选上述巨核细胞是在与巨核细胞相比未分化的细胞中，使选自癌基因、多梳基因、以及细胞凋亡抑制基因中的至少一种基因强制表达之后，解除该强制表达而成的细胞。

另外，本发明是一种方法，其是血小板制剂的制造方法，包括：利用以上记载的方法使巨核细胞生成血小板，从培养物回收血小板的工序；以及从上述血小板除去除血小板以外的血细胞类细胞成分的工序。