[发明专利]PIVKA-II的测定方法及PIVKA-II免疫测定试剂或试剂盒的制造方法

说明书

公开一种能够构建使用针对人凝血酶原的单克隆抗体的、精度更高的PIVKA‑II的免疫学测定体系的手段。本发明的PIVKA‑II的测定方法包含利用免疫测定来测定被检体中的PIVKA‑II。所述免疫测定使用了识别亲水性的PIVKA‑II分子的第1抗凝血酶原抗体或其抗原结合性片段与识别疏水性的PIVKA‑II分子的第2抗凝血酶原抗体或其抗原结合性片段的混合物、以及与PIVKA‑II特异性结合的抗PIVKA‑II抗体或其抗原结合性片段。

技术领域

本发明涉及能够无遗漏地检测被检体中所含的PIVKA-II分子组的PIVKA-II测定方法、及PIVKA-II测定试剂或试剂盒的制造方法。

背景技术

PIVKA-II(Protein induced by vitamin K absence-II，维生素K缺乏诱导的蛋白-II)是具有类似于与血液凝固相关的凝血酶原的结构的糖蛋白。凝血酶原是579个残基的蛋白质，位于N末端附近的10个谷氨酸(Glu)残基受到γ-羧基化而形成γ-羧基谷氨酸(Gla)残基。将该N末端的区域称为Glu-Gla区域。已知凝血酶原在生物体内产生时，会由于维生素K的缺乏，肝功能衰竭、维生素K拮抗剂的给药、肝细胞损伤等，γ-羧基化不完全，在血液中会出现10个残基中的全部或一部分形成了Glu残基的糖蛋白。该蛋白质是也被称为异常凝血酶原的PIVKA-II。近年来，有报道称在肝细胞癌患者血浆中高浓度地检测出PIVKA-II，其已经作为肝细胞癌的标志物被用于诊断的监测中。需要说明的是，除了Glu-Gla区域以外，凝血酶原与PIVKA-II在结构上并无不同，任一蛋白质均在中央区域具有2个三环域(kringle domain)(凝血酶原片段1(F1)区域、凝血酶原片段2(F2)区域)且在C末端具有凝血酶区域。

作为特异性检测被检体中的PIVKA-II的方法，已报道了如下免疫测定法：使用特异性识别PIVKA-II的单克隆抗体和针对凝血酶原的多克隆抗体两者，将其中一者作为固定化抗体、将另一者作为标记抗体而进行测定(专利文献1)。但是，多克隆抗体会由于批次差异而在针对凝血酶原的特异性、亲和性方面产生偏差。为了避免该情况。需要对多个批次的特异性和亲和性进行评价，为了保证更高的特异性，更期望利用单克隆抗体而不是多克隆抗体。

另外，在利用ELISA法的PIVKA-II的测定中，在将特异性识别PIVKA-II的单克隆抗体作为固相抗体、将针对凝血酶原的多克隆抗体作为二抗使用时，已知由于二抗中包含与凝血酶显示反应性的抗体而对血清被检体的测定体系带来不良影响，得不到稳定的测定值(专利文献2)。专利文献2中报道了：为了解决该问题，使用与人凝血酶不反应而与人凝血酶原特异性反应的抗体作为二抗，由此能够使血清被检体保持稳定，从而能够测定PIVKA-II。但是，该方法也使用多克隆抗体，因此与专利文献1存在相同问题。进而，在专利文献2的方法中，为了从针对人凝血酶原的多克隆抗体中除去针对凝血酶的抗体，需要使用人凝血酶原亲和柱取得与凝血酶原反应的抗体后进行透析、进而使用人凝血酶亲和柱取得与凝血酶不反应的抗体并进行透析，抗体的纯化工序非常烦杂。

作为利用ELISA法的PIVKA-II测定技术的另一例子，报道了如下技术：作为固相抗体使用抗PIVKA-II单克隆抗体、作为标记抗体使用PIVKA-II的抗F1单克隆抗体与抗F2单克隆抗体的混合物，来测定PIVKA-II(专利文献3)。根据该技术，能够改善从同一患者中几乎同时采集的血清和血浆的成对被检体的血清、血浆相关性。但是，专利文献3中，并未将PIVKA-II的检测精度本身的提高作为技术问题。

进而，对于血中PIVKA-II的Glu-Gla区域，截至目前已经以脱羧基化部位为中心进行了详细的分析，并提示富于分子多样性。但是，对于除该Glu-Gla区域以外的从三环结构域起至C末侧的PIVKA-II的分子多样性，截至目前尚未进行研究，在上述专利文献1～3中也没有任何记载。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开昭60-60557公报