[发明专利]保存核糖核酸生物活性的方法

说明书

本发明提供了一种基本上保留或以其他的方式保存存在于细胞裂解物中的dsRNA的生物活性,以转录后沉默在靶生物体中的基因表达的方法，该方法包括向该裂解物中添加具有蛋白质‑或胺‑交联剂功能的化合物的步骤。本发明还包括组合物，该组合物包含裂解物，该裂解物包含dsRNA、和蛋白质交联剂，连同所述试剂在该方法中的用途。

本发明涉及通过双链RNA控制基因表达。具体而言，本发明涉及增强外源性-即在靶生物体外部并且在相对苛刻的环境条件下-施用的双链RNA以沉默该生物体中的基因表达的方法。本发明还涉及用于该方法的组合物，以及在该方法中的特定已知交联剂的用途。

潜在沉默基因表达的RNA干扰现象是熟知的。

RNA相对不稳定并且可以通过例如普遍存在于细胞外的核糖核酸酶迅速降解。将dsRNA直接应用于靶生物体，抑或经由外源性施用至它们存在的位置的问题在于RNA的稳定性差。外源性应用意指以生物体可将其并入其中的方式应用于靶生物体，或者dsRNA在与靶生物体不同的第一生物体中产生并且靶生物体并入第一生物体或其包含dsRNA的部分，使得所述dsRNA能够实现包含对应于由dsRNA包含的核苷酸序列的核苷酸序列的基因的转录后沉默。外源性应用与内源性产生(产生是指能够在转录后沉默靶向基因的双链RNA的靶生物体的细胞中产生(通常经由从适当的异源序列表达))不同。

尽管外源施用的dsRNA通常能够在短期内，可能甚至在施用后多至几天内施加相关的生物效应，但该效应一般迅速下降，因为dsRNA在例如土壤中典型地具有仅约12小时至24小时的半衰期，并且还要进一步取决于其施用的精确环境条件。已经提出了对这个问题的不同解决方案，包括通过封装或以其他的方式将其结合到增强其稳定性的聚合物上来稳定dsRNA，从而提供增加的作用持续时间。效应的持续时间有2个方面。基因沉默本身将终止，取决于相关蛋白质的周转率。在环境条件下与土壤孵育时，dsRNA在约2天的时段内降解。虽然dsRNA可能具有基本上比此更长的效应-本发明的优点是增加了dsRNA在环境中的持久性。

因此，本发明涉及解决dsRNA相对快速失活的问题的解决方案，所述dsRNA典型地在通常是有助于其快速降解或失活的田间条件下外源施用于生物体。

根据本发明，提供了一种基本上保留或以其他的方式保存存在于细胞裂解物中的dsRNA的生物活性以转录后沉默在靶生物体中的基因表达的方法，该方法包括向裂解物中添加具有蛋白质-或胺-交联剂功能的化合物的步骤。

“裂解物”简单地是指细胞裂解的产物。然而，尽管优选，裂解可能不一定是100％的，也就是说裂解物可能不包含所有细胞的裂解产物。另一方面，裂解也并不意味着裂解物包含仅仅相对较少的细胞的裂解产物，例如说小于10％的细胞的裂解产物。因此，技术人员将认识到即使其包含相对低百分比的基本上完整的细胞，裂解物仍是裂解物。

典型地通过机械降解或剪切细胞产生细胞裂解物，尽管它们也可以作为细胞失活过程的一部分产生，如当例如通过巴氏灭菌或涉及加热或化学失活的一些其他过程使细菌细胞失活时典型地所发生的。

可以在裂解物形成时将试剂添加到细胞中-即作为形成裂解物的过程的一部分，或在裂解物形成后添加到裂解物中。可替代地，可以将试剂添加到裂解物施用的位置。位置是指任选包含所述试剂的裂解物被施用的位置，并且包括其中植物正在生长的田间，或其中播种了栽培植物的种子的田间，或者将放置所此类种子或植物的土壤，或者实际上是田间、土壤、种子和/或植物本身。可能在施用裂解物之前，将药剂添加到所述位置。

在该方法的一个优选实施例中，所述位置是土壤，并且将该组合物在植物附近施用于其上，以期望通过将dsRNA靶向昆虫有害生物例如玉米根虫中的必需基因对其进行保护。