[发明专利]临床级别视网膜色素上皮细胞的可再现的分化方法

说明书

本文提供了从多能干细胞(PSC)的起始细胞悬浮液例如单细胞悬浮液产生RPE细胞群体的方法。这样的方法可包括在分化培养基中培养PSC的起始单细胞悬浮液以产生人RPE细胞。

本申请要求2015年9月8日提交的美国临时申请号62/215,579的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

联合研究协议涉及的各方

本发明是在本发明作出之时有效的联合研究协议范围内而进行的活动的结果。所述联合研究协议涉及的各方是美利坚合众国政府，美国健康和人类服务部，由国立眼科研究所代表，该研究所是美国国立卫生研究院的一个研究所，和细胞动力国际有限公司。

背景

1.发明领域

本公开一般而言涉及干细胞生物学领域。更具体地，涉及有效产生用作细胞治疗的干细胞来源的视网膜色素上皮细胞群体的方法。

2.相关技术的描述

视网膜是组织的光敏层，其布置在眼睛的内表面。视网膜中的感光器细胞(杆或锥细胞)对光直接敏感，并将化学光信号转化为触发神经冲动的电活动。视网膜色素上皮细胞(RPE)是一层形成血-视网膜屏障的色素细胞。RPE细胞在维持视觉功能以及从视网膜下腔至血液的离子、水和代谢终产物的转运中发挥重要作用(Strauss等人，2005)。此外，RPE细胞通过分泌免疫抑制因子来建立眼的免疫赦免(immune privilege)。RPE细胞的紊乱或损伤可导致视网膜变性、失去视觉功能和失明。视网膜的几种疾病(包括急性和年龄相关性黄斑变性和贝斯特病)涉及RPE的退化；因此，细胞替代治疗是保持视力的一种可能的治疗选择(Buchholz等人，2009)。

通常，干细胞是未分化的细胞，其可以产生一系列成熟的功能细胞。例如，造血干细胞可产生任何不同类型的终末分化血细胞。胚胎干(ES)细胞来自胚胎并且是多能的，因此具有发育成任何器官或组织类型(包括RPE细胞)的能力。

在2006年诱导多能干细胞(iPS细胞)从成年小鼠体细胞的产生提供了干细胞研究、药物研发、疾病模型和细胞治疗的重大突破(Takahashi等人，2006)。人iPSC可以分化为特定的细胞类型，并且具有用于再生医学的患者特异性、免疫匹配的细胞的潜力(Yu等人，2007)。

已显示iPSC产生眼细胞，包括RPE细胞(Hirami等人，2009)。然而，目前已知的用于产生iPSC-或ESC-来源的RPE细胞的全部技术都依赖于使用胚状体的起始群体。缺乏用于有效地大规模产生用于治疗、筛选测试、视网膜疾病模型和RPE生物研究所需的iPSC-或ESC来源的RPE细胞的方法。

概述

不幸的是，从胚状体的起始群体，从多能细胞例如iPSC或ESC常规地和可再现地产生RPE是存在问题的，这是由于产生胚状体的方法本身是不可再现的，具有变化的效率，无法按比例放大，而这是RPE的商业规模生产所需的。本文公开了获得视网膜色素上皮(RPE)细胞群体的方法，其避免了使用胚状体的需要，而是使用多能干细胞的细胞悬浮液群体，优选单细胞悬浮液，而不是使用胚状体。在某些实施方案中，多能干细胞的起始细胞群体可以是例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

在某些实施方案中，提供了用于将多能干细胞分化为视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法。例如，多能干细胞是诱导的多能干细胞(iPSC)。在一个实施方案中，提供了用于产生人RPE细胞的方法，其包括：(a)获得包含解离成基本上单个细胞的人诱导多能干细胞(iPSC)的起始群体；(b)在视网膜诱导培养基中培养所述iPSC以启动细胞向视网膜谱系细胞的分化；(c)在视网膜分化培养基中进一步培养视网膜谱系细胞以进一步分化视网膜谱系细胞；(d)在视网膜培养基中培养细胞以形成分化中的RPE细胞；和(e)在RPE成熟培养基中培养RPE细胞，从而产生人RPE细胞。在一些实施方案中，所述方法不包括形成胚状体。在一些方面，RPE细胞在产生之后冷冻保存。