[发明专利]血浆DNA的多重扩增检测测定以及分离和检测在审
申请号: | 201680061631.1 | 申请日: | 2016-10-26 |
公开(公告)号: | CN108350485A | 公开(公告)日: | 2018-07-31 |
发明(设计)人: | H.阿拉维;G.P.利德加德;B.艾曾斯坦;T.J.桑德尔;M.贾库莫普洛斯;M.W.凯泽;M.M.格雷;A.M.瓦卡罗 | 申请(专利权)人: | 精密科学发展有限责任公司 |
主分类号: | C12Q1/6806 | 分类号: | C12Q1/6806;C12Q1/686 |
代理公司: | 北京市柳沈律师事务所 11105 | 代理人: | 张文辉;易方方 |
地址: | 美国威*** | 国省代码: | 美国;US |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 亚硫酸氢盐处理 多重扩增检测 分离和检测 表征样品 多重扩增 血浆样品 血液产品 分离DNA 血浆DNA 样品DNA 低水平 扩增 血液 检测 | ||
1.一种分析多个靶核酸的样品的方法,所述方法包括:
a)提供具有体积x的样品,所述样品包含疑似含有多个n个不同靶区域中的一个或多个的经亚硫酸氢盐处理的DNA,其中至少一个所述靶区域是低拷贝靶标,如果存在于所述样品中,其以这样的拷贝数存在于所述样品中,使得:
i)在所述样品的n个部分中每个部分具有x/n的体积,所述n个部分中的一个或多个不存在所述低拷贝靶标,或
ii)在所述样品的n个部分中每个部分具有x/n的体积,所述n个部分中的一个或多个中的所述低拷贝靶标低于用于所述低拷贝靶标的检测测定的灵敏度水平;
b)在其中在所述n个不同靶区域存在于所述样品中时,扩增所述靶区域以形成具有体积y的预扩增的混合物的条件下,将所述样品的所述体积x处理至扩增反应;
c)将所述预扩增的混合物分配至多个不同的检测测定反应混合物中,其中每个检测测定反应混合物包含一部分所述预扩增的混合物,所述预扩增的混合物具有y/n或更小的体积,并且其中所述低拷贝靶标,如果在步骤a)中存在于所述样品中,则存在于每个所述检测测定反应混合物中;
d)用所述检测测定反应混合物进行多个检测测定,其中所述不同的靶区域,如果在步骤a)中存在于所述样品中,则在所述检测测定反应混合物中被检测到。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述经亚硫酸氢盐处理的DNA来自人受试者。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中从体液制备所述样品。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述体液包括血浆。
5.根据权利要求4所述的方法,其中由从血浆分离的无细胞DNA制备所述样品。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述无细胞DNA的长度小于200个碱基对。
7.根据权利要求5所述的方法,其中所述无细胞DNA通过方法从所述血浆分离而来,所述方法包括:
a)将所述血浆样品与以下试剂组合:
ⅰ)蛋白酶;和
ii)第一裂解试剂,所述第一裂解试剂包含
-硫氰酸胍;和
-非离子型去污剂;
以形成其中蛋白质被所述蛋白酶消化的混合物;
b)在其中DNA与所述二氧化硅颗粒结合的条件下向步骤a)的混合物中添加
iii)二氧化硅颗粒,和
iv)第二裂解试剂,所述第二裂解试剂包含:
-硫氰酸胍;
-非离子型去污剂;和
-异丙醇;
c)从b)的混合物中分离具有结合的DNA的二氧化硅颗粒;
d)向具有结合的DNA的分离的二氧化硅颗粒中添加所述第一种洗涤溶液,所述第一种洗涤溶液包含:i)盐酸胍或硫氰酸胍,和ii)乙醇;
e)从所述第一洗涤溶液分离具有结合的DNA的二氧化硅颗粒;
f)向具有结合的DNA的分离的二氧化硅颗粒中添加所述第二洗涤溶液,所述第二洗涤溶液包含缓冲剂和乙醇;
g)从所述第二洗涤溶液中分离洗涤的具有结合的DNA的二氧化硅颗粒;和
h)从所述洗涤的具有结合的DNA的二氧化硅颗粒洗脱DNA。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述蛋白酶是蛋白酶K蛋白酶。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法,其中从至少1mL,优选至少5mL,更优选至少10mL体液制备所述样品,和/或其中所述样品的体积x为至少10μl,优选至少25μl,更优选至少50μl,更优选至少100μl,并且其中步骤b的扩增反应中的所述样品的体积为至少20至50%的扩增反应的总体积。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中n为至少3,优选至少5,更优选至少10,更优选至少20。
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