[发明专利]用于产生肉毒杆菌毒素的方法

说明书

本发明涉及一种用于产生肉毒杆菌毒素的方法，其包括：(a)用酸处理肉毒杆菌毒素产生菌株的培养物以形成含有肉毒杆菌毒素的沉淀物；(b)将缓冲液添加至步骤(a)的含有肉毒杆菌毒素的沉淀物，随后通过选自由以下组成的组的至少一个方法澄清：深层过滤(DF)、微滤(MF)、超滤(UF)、无菌过滤、膜色谱(MC)和离心；(c)使步骤(b)的含有肉毒杆菌毒素的溶液经过UF渗滤、硫酸铵沉淀或盐酸沉淀，然后在缓冲溶液中稀释由UF渗滤产生的渗余物，或在缓冲液中溶解由硫酸铵沉淀产生的沉淀物或盐酸沉淀物；和(d)使步骤(c)的渗余物稀释液、硫酸铵沉淀物溶液或盐酸沉淀物溶液经过阴离子交换色谱(AEX)以纯化所述肉毒杆菌毒素。

技术领域

本发明涉及用于通过无动物产品(APF)过程产生肉毒杆菌毒素的方法，并且更具体地，涉及用于产生肉毒杆菌毒素的方法，其包括以下步骤：(a)用酸处理肉毒杆菌毒素产生菌株的培养物以形成含有肉毒杆菌毒素的沉淀物；(b)将缓冲液添加至步骤(a)的含有肉毒杆菌毒素的沉淀物，然后通过选自由以下组成的组的一个或多个方法澄清：深层过滤(DF)、微滤(MF)、超滤(UF)、无菌过滤、膜色谱(MC)和离心；(c)使步骤(b)的含有肉毒杆菌毒素的溶液经过UF渗滤、硫酸铵沉淀或盐酸沉淀，然后在缓冲溶液中稀释由所述UF渗滤产生的渗余物，或在缓冲液中溶解由所述硫酸铵沉淀产生的沉淀物或盐酸沉淀物；和(d)使步骤(c)的渗余物稀释液、硫酸铵沉淀物溶液或盐酸沉淀物溶液经过阴离子交换色谱(AEX)，由此纯化所述肉毒杆菌毒素。

背景技术

自20世纪80年代以来，已经发现了分泌神经毒性毒素的多种梭菌属菌株，并且在过去70年中对分泌自这些菌株的毒素进行了表征。

源自梭菌属(Clostridium sp.)菌株的神经毒性毒素，即肉毒杆菌毒素，根据其血清学性质分为八种类型(A型至H型)。该毒素中的每种具有具有约150kDa大小的毒素蛋白，并且天然含有若干个无毒蛋白与其结合的复合体。中等复合体(300kDa)由毒素蛋白和无毒非血凝素蛋白组成，并且大型复合体(450kDa)和非常大的复合体(900kDa)由结合至血凝素的中等大小的复合体组成(Sugiyama,H.,Microbiol.Rev.,44:419,1980)。已知这样的无毒蛋白具有保护毒素免受低pH和肠内多种蛋白酶的作用。

该毒素在细胞中被合成为具有约150kDa的分子量的单一多肽，然后通过细胞内蛋白酶的作用或用人工酶如胰蛋白酶处理从N-末端开始在1/3位置切割成两个单元：轻链(L；分子量：50kDa)和重链(H；分子量：100kDa)。与单一多肽相比，裂解的毒素具有大大增加的毒性。这两个单元通过二硫键彼此连接并具有不同的功能。重链与靶细胞的受体结合(Park.M.K.et al.,FEMS Microbiol.Lett.,72:243,1990)并且起在低pH(pH 4)下与生物膜相互作用以形成通道(Mantecucco,C.et al.,TIBS.,18:324,1993)的功能，并且轻链具有药理学活性，因此使用去垢剂赋予细胞通透性，或者当通过例如电穿孔被引入细胞时干扰神经递质的分泌(Poulain,B.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,85:4090,1988)。

该毒素抑制在神经肌肉接头的胆碱能突触前处的乙酰胆碱的胞外分泌而引起无力。认为，即使用极少量的毒素处理也表现出毒性，这表明毒素具有若干酶活性(Simpson,L.L.et al.,Ann.Rev.Pharmaeol.Toxicol.,26:427,1986)。

根据最近的报道，该毒素具有金属肽酶活性，并且其底物包括突触泡蛋白、突触融合蛋白、25KDa的突触体相关蛋白(SNAP25)(它们是胞外分泌机械复合体(exocytosismachinery complex)的单元蛋白(unit protein))等。每种类型的毒素使用上述三种蛋白之一作为其底物，并且已知B、D、F和G型毒素在特定位点切割突触泡蛋白，A和E型毒素在特定位点切割SNAP25，并且C型在特定位点切割突触融合蛋白(Binz,T.et al.,J.Biol.Chem.,265:9153,1994)。