[发明专利]用于特异性转变靶向DNA序列的核酸碱基的革兰氏阳性菌的基因组序列的转变方法、及其使用的分子复合体

权利要求书

1.修饰革兰氏阳性菌具有的双链DNA的靶向位点的方法，其包括：使复合体与该双链DNA接触，在该复合体中特异性结合选择的双链DNA中的靶核苷酸序列的核酸序列识别模块与核酸碱基转变酶结合，不进行外来DNA的插入且不切割该靶向位点中的该双链DNA的至少一条链，而使该靶向位点的1个以上的核苷酸缺失或转变为其它的1个以上的核苷酸，或者向该靶向位点插入1个以上的核苷酸的步骤，该双链DNA与该复合体的接触通过向该革兰氏阳性菌导入编码该复合体的核酸来进行，

其中所述核酸序列识别模块为Cas9的至少1种DNA切割能力失活的CRISPR-Cas9系统，且

其中所述核酸碱基转变酶为胞苷脱氨酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸序列识别模块为Cas9的两种DNA切割能力失活的CRISPR-Cas9系统。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其使用与不同的靶核苷酸序列分别进行特异性结合的两种以上的指导RNA。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述不同的靶核苷酸序列存在于不同的基因内。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述核酸碱基转变酶为PmCDA1。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述革兰氏阳性菌为除了芽孢杆菌(Bacillus)属以外的微生物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述革兰氏阳性菌为属于梭菌(Clostridium)属、短芽孢杆菌(Brevibacillus)属或棒状杆菌(Corynebacterium)属的微生物。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，属于梭菌属的微生物为糖丁酸梭状芽胞杆菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，属于短芽孢杆菌属的微生物为桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)。

10.根据权利要求7所述的方法，其中，属于棒状杆菌属的微生物为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其包括：

将以能够控制表达时期的形式包含编码所述复合体的核酸的表达载体，导入所述革兰氏阳性菌的步骤，以及

在为了固定双链DNA的靶向位点的修饰所必需的时期，诱导该核酸的表达的步骤。

12.核酸修饰酶复合体，其为使由核酸碱基转变酶、和与革兰氏阳性菌具有的双链DNA中的靶核苷酸序列进行特异性结合的核酸序列识别模块结合而成的复合体，其在该革兰氏阳性菌中起作用，不进行外来DNA的插入且不切割靶向位点中的该双链DNA的至少一条链，而使该靶向位点的1个以上的核苷酸缺失或转变为其它的1个以上的核苷酸，或者向该靶向位点插入1个以上的核苷酸，

其中所述核酸序列识别模块为Cas9的至少1种DNA切割能力失活的CRISPR-Cas9系统，且

其中所述核酸碱基转变酶为胞苷脱氨酶。

13.编码权利要求12所述的核酸修饰酶复合体的核酸。