[发明专利]调节重组蛋白生产状况的方法

说明书

本发明涉及用于在细胞培养过程中调节由哺乳动物宿主细胞表达的重组蛋白的糖基化的方法和组合物。还公开了在渗透压保持恒定同时含二糖或三糖的细胞培养基中培养表达重组蛋白的宿主细胞的方法。

发明领域

本发明涉及用于在细胞培养过程中调节由哺乳动物宿主细胞表达的重组蛋白的糖基化的方法和组合物。还公开了在渗透压保持恒定同时含二糖或三糖的细胞培养基中培养表达重组蛋白的宿主细胞的方法。

背景技术

蛋白质如治疗性蛋白质或抗体的糖基化状况是重要的特征，由于其对例如折叠、稳定性和抗体依赖性细胞毒性(ADCC，负责抗体治疗效果的机制之一)的影响而导致半衰期和亲和力变化，进而影响蛋白质的生物学活性。糖基化高度依赖于用来生产感兴趣蛋白质的细胞系以及细胞培养过程(pH，温度，细胞培养基组成，原料批次间区别，培养基过滤材料，空气等)。

ADCC活性受与Fc区的寡糖连接的岩藻糖和/或甘露糖的量影响，随着岩藻糖减少和/或甘露糖增加可观察到活性增强。事实上，例如，与岩藻糖化的IgG相比，非岩藻糖化形式表现出显着增强的ADCC，这是由于FcγRIIIa结合能力增强并且没有任何补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗原结合能力的可测的变化(Yamane-Ohnuki和Satoh，2009)。类似地，显示高水平甘露糖-5聚糖的抗体也呈现更高的ADCC(Yu等，2012)。因此，在ADCC反应是抗体活性的主要治疗机制的情况下，提供方法制备糖基化状况以岩藻糖化降低和/或甘露糖化升高为特征的重组治疗性蛋白质是有益的。非岩藻糖化和/或高甘露糖化抗体的优点还包括在低剂量下达到治疗效果。然而，目前市场上的许多治疗性抗体都是高度岩藻糖化的，因为它们由哺乳动物细胞系产生，这些细胞系具有负责产物的Fc N-聚糖的核心岩藻糖化的内在酶活性。

由于糖基化(例如甘露糖化和/或岩藻糖化)可影响治疗效用和安全性，蛋白质糖基化的调整对于市售治疗性蛋白质或抗体具有特殊意义。此外，在生物仿制药化合物框架内，重组蛋白糖基化状况的控制是至关重要的，因为所述重组蛋白的糖基化状况必须与参照产物的糖基化状况相当。

优化培养条件以获得最大可能生产力是重组蛋白生产的其他主要目标之一。从经济角度来看，即使生产力的稍稍提高也会具有重要意义。许多商业上相关的蛋白质在宿主细胞中重组生产。因此需要以有效且经济的方式生产这些蛋白质。不幸的是，重组蛋白生产的缺点之一是进行细胞培养的条件通常使细胞活力随着时间的推移而降低，从而降低了效率和整体生产力。

灌注培养、分批培养和分批补料培养是培养用于生产重组蛋白的动物细胞的基本方法。通常，特别是在分批补料培养和灌注方法中，将诱导剂添加到培养基中以增加细胞中蛋白质的产量。这些诱导剂诱导细胞产生更多的所需产物。此类试剂之一是丁酸钠。然而，在细胞培养中使用丁酸钠的缺点是它显著影响细胞活力。例如，Kim等(2004)报道，虽然丁酸钠能够在分批培养中增加重组CHO细胞中的蛋白质产量，但在生产运行结束时(培养8天后)，细胞活力小于45％。以灌注分批培养重复该实验，作者发现，接受处理6天内细胞活力低至15％。

尽管使用诱导剂可以增加蛋白质产量，但是关于细胞活力的缺点不容忽视。事实上，使用熟知的诱导剂如丁酸钠在培养约5天后就可能会适得其反，而在分批补料模式下典型的生产期为12至15天，并且在灌注模式可以高达40-45天。

由于许多蛋白质是由细胞培养生长6天以上重组产生的，需要方法来允许更有效的多轮生产运行，同时长期维持可接受细胞活力。

还需要这样的培养条件和生产方法，其不仅能够通过在生产期间保持高细胞密度、提高收获滴度或避免细胞活力显著降低来提高重组蛋白生产力，而且还能够控制重组蛋白的糖基化状况，例如岩藻糖化和/或甘露糖化状况。本发明通过提供用于增加重组蛋白产量和/或调整重组蛋白糖基化且对生产效率没有负面影响的方法和组合物来满足这些需要。

发明内容