[发明专利]合成DNA部件、途径和基因组的平行功能性检测

说明书

本发明涉及一种确定人工遗传元件的功能性的方法。将设计为起到与天然遗传元件相同的生物学功能的人工遗传元件引入细胞，并使所述细胞经受高频转座子诱变条件。随后，从所述细胞获得代表转座元件的插入位点的DNA序列组，并确定转座元件在天然遗传元件和人工遗传元件中的插入频率。对转座子插入频率进行比较，从而可以对所述人工功能性元件指定功能性可能性，如果转座子插入频率对于两种元件基本相等则该功能性可能性高，而如果转座子在人工遗传元件中的插入频率更高则该功能性可能性低。

合成生物学有希望解决有挑战性的全局性问题。对从可再生资源产生食物、燃料或化合物的途径和整个微生物细胞的生物系统设计特别受关注。近来，已成功组装了大的生物合成途径甚至全染色体的合成拷贝。尽管有这些成就，大多数的大规模合成工作维持了来自由野生型模板的基因构成和序列。然而，从头合成的实际潜力在于对缺乏生物对应体的完全重构的DNA分子的工程化。

合成生物学的主要挑战在于以更有效的方式来引导设计-构建-检测循环。目前，对合成DNA分子的误差诊断和调试(debugging)仍极为困难，并且模块所包含的组分越多则越费力。已有知识受限于基因组规模的重构如何影响DNA编码的指令的功能性，这仅是因为没有可利用的探测合成基因组构建体的功能性的快速且成本有效的测试方法。DNA重构对功能性的结果往往不显著且难以预料。因为单个碱基取代可能是中性的或者完全破坏所编码的生物学功能，因此难以梳理出DNA序列中的哪些变化是可容许的而哪些则会消除所编码的遗传功能。解码DNA所编码的功能性(即，确定基因是否能够将其功能归存于细胞体系内)远比DNA测序更具挑战性。因此，对于改变序列存在犹疑，并且序列保真度相比功能保真度更被珍视。

本发明的目的在于提供可对合成的DNA部件进行大规模平行功能性检测的手段和方法。该目的通过独立权利要求的主题来实现。

本发明实现了将对重构生物系统的工程化提升至基因组规模，以及通过基于转座子的循环检测策略(下文也称为“Tncite”)来评估合成的基因组设计的部件功能性。

通过Tncite，可以在碱基对分辨率上平行地检测各个DNA编码部件的功能性。所述方法可以用于以下任何遗传部件：i)赋予核心细胞功能的遗传部件，或ii)有条件地必需的遗传部件，或iii)对于特定生长条件或环境具有高适合度相关性的遗传部件，或iv)编码这样的生物学组分的遗传部件：诸如其终产物是必需的或能遗传偶联至阳性选择标志物的生物合成途径。

Tncite部件检测方法基于三步过程(图1)。

第一步：将合成包含必需的或高适合度的基因功能的DNA构建体(其尺寸至多为整个人工基因组)(合成DNA部件拷贝)引入携带着具有等同基因功能的染色体拷贝或游离基因拷贝(祖源或天然部件拷贝)的细胞中。如果合成部件和祖源部件(ancestral part)具有相似的序列，则在设计过程中使用中性重编码或者其他碱基对取代来在合成部件中引入水印(watermark)，从而将合成序列明确区分于对应的祖源部件序列。

第二步：使细胞进行高通量转座子诱变，并在选择性生长条件下培育。

第三步：使用高通量测序(转座子测序)在祖源或合成部件拷贝中对Tn(转座子)插入位点作图。对于各个部件找出的转座子插入的数目给出了部件功能性的精确量度。

如果合成部件具有完全功能性，则会在祖源部件拷贝和对应的合成部件拷贝两者中观察到相等的转座子插入频率(图2)。如果合成部件不具功能性，则祖源部件拷贝不含或仅含极少的干扰性转座子插入(因为祖源部件功能不会为合成部件拷贝所补偿)(图2)。