[发明专利]功能性肺血管床的再生

说明书

一种用于血管再生的方法，该方法包括将内皮细胞递送至肺支架，将血管周细胞递送至该肺支架，并向该支架提供多阶段培养程序。该多阶段培养程序包括第一阶段和第二阶段，该第一阶段包括递送血管生成培养基，该血管生成培养基例如具有40ng/ml‑100ng/ml促血管生成因子，并且该第二阶段包括递送稳定化培养基，该稳定化培养基例如具有0.5％‑2％血清和1ng/ml‑20ng/ml血管生成因子。

技术领域

本披露涉及功能性肺血管床的再生。

背景技术

对于患有末期肺病的患者，肺移植是一种有效的治疗选择。然而，供体数量并不能满足日益增长的需求，而慢性免疫抑制和排斥反应的影响限制了长期结果。肺移植的典型等待时间可以为两年或更长时间，导致等待名单上的人的死亡率为30％。

发明内容

本披露至少部分是基于以下设备(例如，生物反应器)和方法的开发，这些设备和方法能够通过递送细胞并用内皮和血管周细胞重新填充无细胞肺支架的血管隔室来再生功能性肺血管床并使用多阶段培养程序使该肺血管床成熟。实现方式可以包括以下特征中的一个或多个。

在第一方面，本文提供了用于血管再生的方法，这些方法包括将内皮细胞递送至肺支架；将血管周细胞递送至该肺支架；并且向该支架提供多阶段培养程序，该多阶段培养程序包括：第一阶段，该第一阶段包括递送具有40-100ng/ml促血管生成因子的血管生成培养基；以及第二阶段，该第二阶段包括递送具有0.5％-2％血清和1ng/ml-20ng/ml血管生成因子的稳定化培养基。

在一些实施例中，这些促血管生成因子包括重组人VEGF、bFGF、ANG1、EGF和PDGF中的至少一种或多种，例如，两种、三种、四种或全部五种。

在一些实施例中，该稳定化培养基包括毛喉素和/或氢化可的松中的至少一种。

在一些实施例中，这些方法包括将该肺支架维持在围绕该肺支架的生物反应器中，该生物反应器包括气管管线、动脉管线和静脉管线。在一些实施例中，该肺支架包括气道和脉管系统，并且该方法包括将该气道连接至该气管管线；将该肺支架连接至该动脉管线和该静脉管线；并且经该动脉管线和该静脉管线对该肺支架接种细胞。

本文还提供了用于血管再生的方法，这些方法可以包括将HUVEC和血管周支持性hMSC递送至肺支架；在第一阶段期间将血管生成培养基递送至该肺支架；并在第二阶段期间将稳定化培养基递送至该肺支架。

在一些实施例中，这些方法包括将该肺支架维持在围绕该肺支架的生物反应器中，该生物反应器包括气管管线、动脉管线和静脉管线，其中通过该动脉管线和该静脉管线递送这些HUVEC和这些血管周支持性hMSC。

此外，本文提供了用于从人类诱导多能干细胞(hiPSC)中分化内皮细胞和血管周细胞的方法。这些方法包括在至少一种GSK3抑制剂的存在下培养这些hiPSC；在完全分化培养基的存在下培养这些hiPSC；用补充有TGF-β1抑制剂的该分化培养基培养这些hiPSC；并分离hiPSC衍生的血管周祖细胞(hiPSC-PPC)和hiPSC衍生的内皮细胞(hiPSC-EC)。

在一些实施例中，该至少一种GSK3抑制剂是CHIR99021。在一些实施例中，该至少一种TGF-β1抑制剂是SB431542。

在一些实施例中，这些方法包括维持4％或更少O₂的低氧培养条件。

在一些实施例中，这些方法包括包括测量由CD31和VE-钙粘蛋白表达定义的内皮覆盖度的增加平台期，以指示足够的血管和第一阶段培养的结束。