[发明专利]测序技术中的脱靶捕捉降低

说明书

本文中呈现了用于增强核酸文库(10)中靶序列(14)的特异性富集的方法和组合物。可以使用脱靶杂交探针(60)来减少靶向测序工作流中核酸文库(10)的脱靶区域的结合和/或捕捉。脱靶杂交探针对于已知对特定组的杂交探针(20)产生脱靶测序读段的位置可以是特异性的。

对相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年10月7日提交的标题为“DATA-GUIDED DESIGN OF HYBRIDCAPTURE OFF-TARGET REDUCERS”的美国临时申请No.62/238,411的优先权，其公开内容通过引用并入本文用于所有目的。

发明背景

本公开一般涉及核酸测序技术领域。更具体地，本公开涉及用于富集靶物捕捉并且降低靶向测序工作流中待测序的核酸的脱靶捕捉的技术。

下一代测序(NGS)平台的测序方法通常利用核酸片段文库。在靶向测序技术中，从核酸文库中分离含有基因组的感兴趣基因或区域的片段的亚组并对其测序。使用NGS的靶向性方法使研究人员将时间、费用和数据分析集中在特定的感兴趣领域。此类靶向分析可以包括外显子组(基因组的蛋白质编码部分)、感兴趣的特定基因(定制内容)、基因内的靶物、或线粒体DNA。靶向性方法与更全面的全基因组测序方法形成对比，但也涉及对所有用户可能不感兴趣的基因组测序区域。

在靶向测序技术的一个实例中，杂合捕捉方法使用与核酸文库中的靶序列杂交的探针组或集。探针与靶序列的杂交允许将这些序列与测序文库中的片段的剩余部分分开。通过仅靶向核酸文库的一部分，杂合捕捉方法避免了不含感兴趣序列的脱靶(off-target)核酸片段的测序。然而，与基于扩增子的靶物富集方法不同，杂合捕捉方法具有较高的脱靶测序率，并且继而降低了中靶(on-target)特异性。例如，尽管使用商业杂交封闭剂如Cot1、tRNA、鲑鱼精DNA、聚(dIdC)和靶向文库片段通用衔接头的封闭剂，但某些杂合捕捉方法通常仅实现40％-60％的效率。脱靶读段不仅浪费测序产率，而且还潜在地损害低频率的体细胞突变的变体调用(variant calling)。因此，需要改进的富集方法，其在靶向测序技术中提供较高的特异性。

发明概述

本文中呈现了用于富集核酸文库中的靶序列并通过一组靶物杂交探针降低脱靶序列捕捉的技术。因为靶物杂交探针对它们的核酸靶物具有不完全特异性，所以使用一组靶物杂交探针的测序运行也可以包括代表脱靶的序列的一定百分比的读段。例如，在外显子组测序反应中，某些杂交探针可以连同靶序列一起从核酸文库中拉下内含子或基因间序列。这些脱靶片段一旦被拉下就存在于被测序的核酸片段合并物中。虽然通常弃去代表脱靶读段的测序信息，但是本技术使用获得的这些脱靶读段的测序信息来设计杂交探针，所述杂交探针对于脱靶序列是特异性的并且用于从通过靶物特异性杂交探针捕捉的片段合并物中分离和/或除去包含这些序列的片段。脱靶杂交探针是基于分析用一组靶物杂交探针进行的杂合捕捉测序运行的脱靶读段而设计的。在某些实施方案中，中靶探针设计也可以基于样品间的系统性脱靶分析以改善靶物杂交探针对其期望靶物的特异性。

本文中呈现了降低靶向测序反应中的脱靶捕捉的方法。方法包括以下步骤：提供一组脱靶杂交探针，所述脱靶杂交探针特异性结合存在于从样品产生的核酸文库中的多个脱靶序列，所述核酸文库包含多个核酸片段并提供一组靶物特异性杂交探针，所述靶物特异性杂交探针特异性结合存在于核酸文库中的多个靶序列。方法还包括以下步骤：在脱靶杂交探针与脱靶序列杂交的条件下使脱靶杂交探针与核酸文库接触，并在靶物特异性杂交探针与靶序列杂交的条件下使靶物特异性杂交探针与核酸文库接触。方法还包括以下步骤：从核酸文库中选择与靶物特异性杂交探针结合的一组核酸片段；并且对与靶物特异性杂交探针结合的该组核酸片段测序。