[发明专利]在解吸条件下从发酵固体纯化蛋白质的方法

说明书

本发明涉及一种从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的方法，包括从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤，其中从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤包括一个或多个洗涤步骤，其包括将颗粒物质接触洗涤液，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件。

发明领域

本发明涉及从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的方法，包括从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤，其中从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤包括一个或多个洗涤步骤，其包括将颗粒物质接触洗涤液，所述洗涤液包括一种或多种有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件。

发明背景

通过培养选定的产生有用物质的微生物的这些物质的生物技术生产现在具有相当大的工业意义。尤其是，蛋白质的工业生产，特别是洗涤-和/或清洁-活性酶，还有药物活性蛋白质，在过去几十年里通过发酵生产不断增加。

对于待掺入商业产品中的发酵产物，完成发酵过程后，通常需要从发酵液的颗粒物质中纯化。然而，从培养液收集发酵产物，尤其是收集目标蛋白质，常常受到以下情况的阻碍：相当大量的发酵产物不是溶解形式的并且粘附于发酵液中的颗粒物质，导致相当大的产量损失。

本领域中存在各种方法来提高目标蛋白质的溶解性和降低目标蛋白质与发酵液中的颗粒物质(特别是生物质)的结合。

在US6582606中，描述了一种纯化方法，包括将含有savinase的发酵液调节至pH5.2，并随后将CaCl2和活性炭添加至100％稀释的发酵液中。通过随后简单的微滤除去细菌细胞。

WO2011003784公开了一种用于从发酵液纯化淀粉酶或蛋白酶的方法，通过将发酵液的pH调节至pH6.5-pH10.5，随后600％稀释发酵液，并添加CaCl2和磷酸钠。描述了通过随后的离心分离了细菌细胞。作为除去细胞后加工蛋白质溶液的其他方式，WO2011003784建议了进一步纯化，例如，通过超滤、渗滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、沉淀或结晶。

在WO0043502A2中，公开了用于从培养液收集糖苷酶或肽酶的方法，包括在除去细胞前将培养液的pH调节至约9.5至约13的pH值的步骤。在WO0043502A2中，描述了淀粉酶的纯化，其中用水200％(w/w)稀释培养液的样品，补充絮凝剂并将样品的pH调节至pH10.5。随后，通过离心除去生物质，并且测定与酶纯化前发酵液中的酶活性相比，上清液中的淀粉酶活性为80％。

WO2008110498A1描述了一种溶解发酵液中的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀物的方法。在WO2008110498A1中，通过使用以下步骤溶解枯草芽孢杆菌蛋白酶：a)稀释发酵液300％(w/w)；b)添加3％(w/w)CaCl2(36％(w/w))；和c)将发酵液的pH值调节至pH4.5或4.2的pH值。随后通过离心除去生物质。

因此，所有已知的方法需要在除去细胞前用水大量稀释发酵液，以获得良好的蛋白质产量。

此外，现有技术中用于工业规模的发酵后的蛋白质纯化的方法中，没有一个公开在有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从发酵液的颗粒物质解吸的条件下洗涤发酵液的颗粒物质。反而，现有技术中描述的用于从发酵液大规模纯化蛋白质的所有方法需要在从发酵液除去细胞前调节发酵液有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从发酵液中的颗粒物质解吸的条件。这使得收集方法复杂化，费事且成本高，并且不可以进行连续处理。

因此，现有技术中用于大规模蛋白质纯化的技术的特征在于复杂的多步程序，其没有允许连续的纯化方法，并且其导致通常与蛋白质纯化前需要发酵液大量稀释相关的不令人满意的产量。

因此，本领域需要促进用于通过发酵方法获得的目标蛋白质的纯化方法，特别地，改进纯化方法，以允许连续的纯化方法并降低由于结晶和沉淀以及由于蛋白质与发酵液的颗粒物质结合引起的纯化过程中的蛋白质损失。