[发明专利]遗传修饰的酵母细胞和改进的用于生产凝块特异性链激酶的方法

说明书

本文中公开了用于在甲基营养酵母中生产和分泌生物活性的凝块特异性链激酶(CSSK)蛋白的表达系统。酵母表达的CSSK蛋白表现出改善的纤溶酶原活化和纤维蛋白选择性。还公开了用功能性cDNA序列的至少一个拷贝转化的甲基营养酵母，所述功能性cDNA序列编码带有经修饰的信号序列的CSSK，所述信号序列导致成熟的和正确加工的CSSK的分泌。

技术领域

本发明涉及用于表达凝块特异性(clot specific)链激酶(CSSK)蛋白的遗传修饰的酵母细胞，其用于改进的CSSK生产。本发明也涉及包含凝块特异性链激酶的表达序列的载体的制备。所述载体具有经修饰的α信号序列和用于在酵母细胞中表达CSSK的CSSK密码子序列。

背景技术

近年来，用纤维蛋白溶解药剂诸如链激酶(SK)、组织型纤溶酶原活化剂(TPA)或尿激酶(UK)的溶血栓疗法已经彻底改变了多种循环系统疾病(例如，深静脉血栓形成、肺栓塞和心肌梗塞)的临床处理。这些药剂通过切割纤溶酶原(PG)中的残基561和562之间的易切断肽键活化循环系统中的纤溶酶原而发挥其纤维蛋白溶解效应。所以，无活性的酶原被转化成其活性形式：丝氨酸蛋白酶纤溶酶(PN)，其然后作用于纤维蛋白以将后者降解成可溶性的降解产物。PG向PN的活化可以由TPA、SK-纤溶酶原复合物和UK催化，它们中的每一种可以切割PG中的易切断肽键。

不同于UK和TPA，SK不具有它自身的蛋白水解活性，并且它通过首先与PG形成高亲和力等摩尔复合物(被称作活化剂复合物)间接地将PG活化为PN(在Castellino,F.J.,1981,Chem.Rev.81:431中综述)。由于在SK中缺乏任何可察觉的纤维蛋白凝块特异性，SK的施用可以造成全身性PG活化，从而导致出血性并发症，其归因于在循环系统中产生的纤溶酶对血液因子的蛋白水解性降解。在过去，编码SK的基因已经从它的天然来源(链球菌属(Streptococcus))分离，并被克隆进几种异源微生物诸如酵母(Hagenson,M.J.,1989,Enzyme.Microb.Technol.11:650)、细菌诸如大肠杆菌(Malke,H,Ferretti,J.J.,1984,Proc.Nat'l.Acad.Sci.81:3557)、链球菌属的其它种(Malke,H.,1984,Mol.Gen.Genet.196:360)和芽孢杆菌属(Bacillus)(Wong,S.L.,1994,Applied andEnv.Microbiol.1:517)中。

美国专利号7,163,817和8,143,027公开了含有SK或其功能相关部分的新颖的凝块特异性链激酶蛋白的制备，所述SK或其功能相关部分与人纤连蛋白的纤维蛋白结合结构域连接，所述纤维蛋白结合结构域赋予纤维蛋白亲和力和改变的纤溶酶原活化特征。所述改变的纤溶酶原活化涉及PG活化速率中几分钟的持续时间的最初延迟阶段，其之后是与天然SK类似的高PG活化速率。

CSSK嵌合蛋白中的纤维蛋白亲和力和延迟的PG活化会在需要溶血栓疗法的受试者的治疗中赋予独特优点。具体地，在注射进体内以后，尽管嵌合的PG活化剂蛋白仍然处于无活性的或部分活性的状态，但是它们会结合血管系统中的病理性纤维蛋白凝块。但是，在最初延迟以后，这些将变成完全活化(同时结合所述凝块)，由此避免与天然SK施用一致的全身性PG活化。因而，CSSK的纤维蛋白亲和力会赋予将它自身靶向至病理性凝块的近场所的能力，并从而帮助在其中积累治疗上有效的活化剂浓度；最初减慢的PG活化的动力学导致总体上减少的游离纤溶酶在循环中的产生，然后它们定位至由病理性纤维蛋白凝块诱导的循环阻抗部位。净结果是在靶标处持续的且更有效的纤维蛋白溶解，其被降低的治疗上有效剂量的CSSK维持。

CSSK的开发已经成为医学界的福利。但是，生产CSSK的现有技术方法是费时的和艰苦的，从而导致低收率和高生产成本。

在本领域已知的方法中，在大肠杆菌细胞内生产凝块特异性链激酶，但是通过溶解在脲/氯化胍(强离液剂)中和随后重折叠而得到生物活性蛋白。所述体外重折叠步骤是费时的，并且可以在非常低的蛋白浓度以高效率进行。另外，大肠杆菌细胞壁含有热原性脂多糖，并且所有基于大肠杆菌的方法需要除去这些内毒素的步骤。