[发明专利]T细胞反应性平台

说明书

本申请涉及用于体外测定抗原特异性T细胞活化的方法，包括以下步骤：(a)提供具有与其紧密缔合的候选抗原多肽的可吞噬颗粒，其中与多肽缔合的颗粒已被进行变性洗涤，导致内毒素水平足够低，从而不干扰后续步骤；(b)提供活的抗原呈递细胞；(c)在允许抗原呈递细胞吞噬颗粒的条件下将洗涤的颗粒与抗原呈递细胞接触；(d)提供待分析的T细胞样品，其包含活的T细胞；(e)在允许T细胞响应于由抗原呈递细胞呈递的抗原而特异性活化的条件下，将T细胞样品与已和颗粒接触的抗原呈递细胞接触；和(f)确定T细胞样品中T细胞活化的程度。

技术领域

本发明涉及测定抗原特异性T细胞活化的诊断和分析方法领域。

背景技术

适应性免疫系统构成免疫系统的一个分支，其是可以特异地适应和响应生物体遇到的不同病原体或细胞破坏性挑战，而不是以更通用的方式进行反应的先天免疫系统。适应性系统包括体液免疫，即B细胞分泌的抗体和T细胞介导的免疫。适应性免疫系统的特异性在于B细胞和T细胞上表达的B细胞和T细胞受体。通过混合基因片段的复杂系统，身体产生几乎无限多样的B细胞和T细胞，每种细胞都表达某种蛋白质或肽的特异性受体。

T细胞是形成适应性免疫系统的主要部分的淋巴细胞，其在细胞介导的免疫中起着核心作用。定义的T细胞受体(TCR)在细胞表面表达，并且每种受体识别在MHC(主要组织相容性复合体)分子的情况下呈递的抗原衍生肽。存在几种类型的T细胞，每种在细胞免疫应答中都具有不同的功能。

简而言之，有具有不同的功能的两种主要类型的T细胞。CD8阳性细胞毒性T细胞将结合存在于细胞上I类MHC受体上的肽(在人类中称为I类人类白细胞抗原(HLA))。所有有核细胞都表达I类HLA。如果呈递的肽被认为是外来的(最常见的是病毒感染的迹象)，则细胞毒性T细胞将通过蛋白质粒酶B或穿孔素杀死细胞。表达表面标记物CD4的辅助性T细胞(Th)不杀伤，而是通过分泌细胞因子协调免疫反应，所述细胞因子为蛋白，其放大细胞之间的促炎信号，以及有时放大抑制信号。T辅助细胞的另一个重要功能是诱导B细胞的类别转换，例如，将分泌IgM的B细胞变成分泌IgG的细胞，这将增加针对抗原的体液免疫应答。

T辅助细胞将通过其TCR结合在MHC-II上呈递的其相应肽(在人类中称为II类HLA)，即在所谓的抗原呈递细胞(APC)或内皮细胞上特异性表达的受体。T细胞活化取决于发生Th-APC相互作用的微环境和在APC上表达的所谓的共刺激分子的类型。T辅助细胞可以分化成不同的Th亚群，例如，促炎性Th1、Th2、Th17细胞或称为调节性T细胞(Treg)的抑制性T辅助细胞类型。后一种子集对于控制免疫应答非常重要，因为不受限制的免疫系统是有害的并且可以导致组织损伤和自身免疫。

存在几种适用于测定抗原特异性T细胞活化的方法，包括ELISpot、Fluorospot、用流式细胞术对细胞因子进行细胞内染色、FASCIA、增殖测定(例如胸苷掺入、CFSE或BrdU染色)、用MHC-I或II的四聚体进行特异性TCR-检测、以及分泌细胞因子的ELISA或Luminex分析。

利用ELISpot技术，可以直接检测细胞响应刺激时特定细胞因子的释放。将细胞接种在膜上并测量分泌细胞因子的细胞的数量。根据正在测量的细胞因子，可以测量不同的变体，例如巨噬细胞或T细胞活化。FluoroSpot基于ELISpot技术，可同时读取几种不同的所分泌的细胞因子。这允许更精确和细致的细胞活化评估。这两种方法都提供了测量T细胞活化的快速而简单的方式。