[发明专利]筛选的方法

说明书

本发明提供了使用哺乳动物编码的肽(SEP)，例如短开放阅读框(sORF)编码的肽，鉴定靶蛋白上的肽相互作用位点的方法，其中所述靶蛋白调节哺乳动物细胞的表型。本发明进一步提供了用于鉴定在药物发现中使用的新的治疗靶和蛋白质相互作用位点的方法。

发明领域

本发明涉及用于鉴定在药物发现中使用的新的治疗靶和新的可成药的(druggable)蛋白质相互作用位点的方法。

发明背景

新的治疗靶的鉴定是药物发现的关键起点。药物发现工作传统上集中于鉴定经典的可成药靶，例如激酶、G蛋白偶联受体(GPCR)和离子通道。然而，此类化学上容易获得的靶并不总是代表生物学上最相关的用于治疗干预的靶。将蛋白质:蛋白质相互作用(PPI)成药特别令人感兴趣，因为这些蛋白质相互作用代表了参与癌细胞利用的缺陷信号传导通路中的主要靶类型，以及人类疾病中一大组潜在可作用的接口。不幸的是，对将PPI和其他“不可成药”的靶成药的系统尝试受到技术的限制，这在很大程度上是由于当前基于DNA和RNA的高通量基因组学技术能在蛋白质组水平上鉴定新的可成药空间的限制。

可以使用无偏的“表型”测定来鉴定与疾病生物学相关的候选药物靶的目前基于基因组学的技术，通常是使用基因敲除(例如CRISPR)来执行，或者在转录物组水平上使用RNAi来执行。这些方法产生了关于哪些靶可以代表在疾病进展和疾病治疗干预中的重要节点的重要信息，但是受到严重限制：因为它们是在基因水平而不是蛋白质水平上进行筛选，所以它们无法确定如何将那些靶成药，也无法作为过程中固有的一部分来确定那些是否代表可成药的候选物。这是因为这样的基因筛选除去了靶蛋白而不是抑制它们。为了获得此类重要的关于可成药性的另外信息，将需要使用新的高通量蛋白质组水平筛选技术；一种可以处理比基因功能(～30,000个基因及其剪接变体)更高复杂性的筛选蛋白质功能(300,000个独特的蛋白质转录本和数百万个独特的PPI)的筛选技术。

最近，随着DNA编码的、蛋白片段表达文库的引入，直接在人蛋白质组中系统鉴定新的药物靶位点获得了一定程度的可操作性和关注，这些文库可以在表型测定中以高通量筛选(诸如WO 2013/116903中所描述的)；常被称为“蛋白质干扰”(Protein-i)。这种蛋白质片段文库(通常来源于不同的细菌基因组)，由形成更大蛋白质的进化构建模块的小的自折叠子结构域组成。当组装为用于哺乳动物细胞中细胞内表达的文库时，它们代表用于对接靶蛋白和探索跨越人蛋白质组的候选的新的可成药位点的三维形状的高度多样化集合。至关重要的是，这些蛋白质片段小到足以描述靶蛋白质中离散的空间位点(discretespatial sites)，因此可以用随后设计成与该形状匹配的小分子药物重现。此外，由于蛋白质片段文库比目前的小分子文库描述了多得多的形状，这为指导对于新的有效靶的未来小分子药物的合理设计提供了更加可靠的方法。

尽管由于细菌基因组主要由编码序列组成，细菌衍生的蛋白片段文库已显示在Protein-i筛选中是有效的，并且通过片段化和克隆到表达文库中而高效率/直接地产生。然而，与使用哺乳动物或人蛋白质组本身的片段相比，它们可在拥有大比例的能与哺乳动物(例如人)蛋白功能性地相互作用的蛋白片段方面动力不足。

然而，直接从哺乳动物(例如人)的基因组创建蛋白质片段文库的复杂性在于，高等生物具有大量得多的编码序列，因此通常需要大量人工定制克隆来将其片段组装为表达文库，以用于表型筛选。这是因为高等生物的DNA大部分地含有非编码序列(估计人DNA的95％是非编码的)，并且编码序列的绝对数量要大得多。因此，它们需要一种独特和特别的方法将其片段组装为表达文库用于表型筛选。