[发明专利]用于蛋白生产的改进的真核细胞及其制备方法

权利要求书

1.一种工程化细胞，优选哺乳动物细胞系的工程化细胞，例如工程化CHO细胞，包括工程化CHO-K1，其包含：

所述细胞的基因组，其中所述基因组包含一个或多个改变，所述改变包括：

作为所述基因组一部分的一个或者多个，通常超过10、20、30、40、50、60、80、90或100个，内源性逆转录病毒(ERV)元件中的一个或者多个核酸的

-缺失，

-添加，和/或

-置换。

2.权利要求1的工程化细胞，其中所述ERV元件来自γ逆转录病毒ERV，包括考拉流行病毒(KoRV)ERV、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)ERV、小鼠白血病病毒(MLV)ERV，并且其中所述一个或多个改变适于抑制或消除一个或多个，优选超过60％、70％、80％、90％、95％或100％的，所述ERV的释放。

3.如以上权利要求任一项的工程化细胞，其中所述一个或多个(ERV)元件是或来自gag基因、pol基因和/或env基因，优选来自编码MA(基质)、CA(壳体)、NC(核壳)的gag基因；编码蛋白例如pp12或p6的另外的结构域；并且/或者是ERV的长末端重复(LTR)。

4.权利要求3的工程化细胞，其中所述一个或多个ERV元件编码Gag(群抗原)蛋白、Pol(逆转录酶)蛋白和/或Env(包膜)蛋白。

5.上述权利要求任一项的工程化细胞，其中所述缺失、添加或置换包括多于2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150或200个核酸。

6.上述权利要求任一项的工程化细胞，其中所述改变是靶向整合形式的添加，并且所述一个或多个(ERV)元件是或者来自gag基因、pol基因和/或env基因的一个或多个，优选gag基因，并且对所述基因的序列进行转基因优选编码标记物蛋白如GFP(绿色荧光蛋白)的转基因的靶向整合，并且/或者当所述一个或多个改变导致显性负性表型时。

7.上述权利要求任一项的工程化细胞，其中所述ERV元件来自gag基因，并且至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、或10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或全部的所述元件包含所述改变。

8.上述权利要求任一项的工程化细胞，其中所述改变位于所述ERV元件的共有序列中，其中所述共有序列的长度为至少5个、10个、15个或20个碱基对，优选15个至25个、或30个至50个碱基对。

9.上述权利要求任一项的工程化细胞，其中所述工程化细胞不释放或基本不释放ERV。

10.上述权利要求任一项的工程化细胞，其中所述细胞包含编码、抑制或激活重组通路的一个或者多个蛋白的异源核酸序列，以及/或者编码抑制所述重组通路优选HR的一个或者多个蛋白的表达的一个或者多个序列或蛋白的异源核酸序列，所述重组通路的一个或多个蛋白甚至更优选Nbs1、Mre11、Rad51、连接酶1和/或连接酶3。

11.权利要求10的工程化细胞，其中所述异源核酸序列以不整合到所述细胞的基因组中的载体形式存在。

12.上述权利要求任一项的工程化细胞，进一步包含编码一个或者多个标记物蛋白例如GFP(绿色荧光蛋白)的异源供体DNA，优选载体上的异源供体DNA。

13.上述权利要求任一项的工程化细胞，其中所述细胞进一步包含转基因。