[发明专利]增强的蛋白质表达及其方法

说明书

本公开总体上涉及产生增加量的一种或多种目的蛋白的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞和具有增强的遗传感受态的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞。因此，本公开的某些实施例涉及相对于表达目的蛋白的未修饰(亲本)革兰氏阳性细菌细胞，表达增加量的相同目的蛋白的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞，其中所述经修饰的细菌细胞在编码变体RNA聚合酶(RNAP)β'‑亚基多肽的rpoC基因中包含至少一个突变。在某些实施例中，将所述编码变体β'‑亚基多肽的rpoC基因整合到所述经修饰的细胞的染色体中。在其他实施例中，将所述编码变体β'‑亚基多肽的rpoC基因包含在引入所述经修饰的细胞的染色体外质粒中。在其他实施例中，本公开涉及感受态芽孢杆菌属宿主细胞，所述感受态芽孢杆菌属宿主细胞包含至少一个拷贝的核酸构建体，其编码经修饰的rpoC多肽，所述经修饰的rpoC多肽包含与SEQ ID NO:8的90％的序列同一性和在SEQ ID NO:8的位置796处的天冬氨酸至甘氨酸的取代，其中所述编码rpoC多肽的多核苷酸对于在引入所述第一核酸构建体之前是非感受态的芽孢杆菌属宿主细胞而言是外源的。

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年10月30日提交的美国临时申请号62/248,228的权益，该临时申请通过引用以其全文特此结合。

技术领域

本公开总体上涉及微生物学、分子生物学、酶学、蛋白质工程等领域。在某些实施例中，本公开涉及产生增加量的一种或多种目的蛋白的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞。在某些其他实施例中，本公开涉及包含增加的遗传感受态的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞。

序列表的提交

命名为“NB40948WOPCT_SEQ.txt”的文本文件序列表的电子提交的内容创建于2016年10月12日，并且大小为71KB，将其以全文通过引用特此结合。

背景技术

已经开发了多种技术来改进多肽的工业生产，包括例如经典的菌株改良方法，例如对菌株进行多轮诱变并选择高产者，构建或基因工程化具有高或高于插入基因组中的一个或多个目的基因的天然拷贝数的生产菌株，将多个拷贝的合适的表达载体引入生产菌株，载体、启动子、融合表达的改进，目的蛋白与分子伴侣的共表达等。

尽管许多上述参考方法和技术对于改进宿主微生物菌株的生产力是有效的，但它们几乎都具有局限性，例如为了制造单个产物的多轮菌株构建操作的劳动强度、不稳定的质粒特别是在宿主细胞培养期间在高拷贝数下丢失、通过将多个拷贝的基因整合到宿主细胞染色体中引起的其不稳定性等等。

因此，本领域仍然需要改进的宿主和/或生产菌株，所述改进的宿主和/或生产菌株能够增加单个目的蛋白的蛋白质生产，增加一种或多种目的蛋白的蛋白质生产，增加一种或多种目的蛋白组的蛋白质生产，增加内源蛋白的蛋白质生产等。

RNA聚合酶(以下称为“RNAP”)是最核心的转录调控中枢之一，并且研究最多的细菌RNAP是大肠杆菌RNAP，其代表从大量细菌属(包括沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、气杆菌属(Aerobacter)和芽孢杆菌属(Bacillus))分离的RNAP酶(参见，Fukuda等人，1977)。

RNAP“核心酶”分别由2:1:1的比率的α、β和β'亚基组成。RNAPα、β和β'亚基分别由rpoA、rpoB和rpoC基因编码。

影响RNAP的突变可以在执行众所周知的选择方案期间产生(Conrad等人，2010；Cui等人，2010)。α-亚基(RpoA)蛋白的突变体版本有时可以实质地改变细胞表型(Klein-Marcuschamer等人，2009)。同样地，在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中导致利福平抗性的β-亚基(RpoB)蛋白的某些突变与涉及生长、感受态、孢子形成和萌发的改变的表达和/或调控相关(Maughan等人，2004)。