[发明专利]能够产生支链化合物的经修饰硫解酶及其用途

说明书

本发明涉及能够产生被认为在工业上特别令人关注的支链化合物的突变硫解酶。本发明还涉及获得所述支链产物的方法。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，并且特别地涉及能够产生用于工业用途的2-支化衍生物化合物的前体的具有硫解酶活性的酶。

背景技术

硫解酶是通过克莱森缩合反应(Claisen condensation reaction)催化非氨基酸酰基(例如乙酰基)转移以形成碳-碳键的酶超家族。存在于其活性中心的半胱氨酸残基的硫酯在所有情况下干扰反应机理。这些酶参与许多代谢途径，包括真核生物和原核生物中的生物合成(合成代谢)和降解(分解代谢)途径。

硫解酶超家族根据功能分为三个家族：(a)β-酮脂酰：酰基-载体-蛋白合酶(β-ketoacyl：acyl-carrier-protein synthase，KAS)，(b)聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)，以及(c)合成性和降解性硫解酶家族。前两组分别参与脂肪酸和复合物聚酮代谢。这两组蛋白质主要依赖于酰基载体蛋白质并参与用于底物激活的羧化过程。

第三组分为两个家族：生物合成性硫解酶(EC 2.3.1.9)和降解性硫解酶(EC2.3.1.16)，但是这两组酶在特定条件下均能够催化正向反应和反向反应二者。

尽管它们的底物特异性不同，但硫解酶超家族保留了一种相同类型的硫解酶折叠，其中每个单体由具有夹心型βαβαβαββ基序的两个相似半部形成。就其四级结构而言，它们通常在生物介质中组织成二聚体或二聚体的二聚体。在后者中，它们是通过四个β6/β7环相互作用的二聚体的二聚体，每个单体一个，并且其中相互作用主要是疏水型相互作用。

属于硫解酶家族的酶具有约400个残基，具有连接N末端和C末端两个相似结构域并具有βαβαβαββ折叠的约20个残基的广泛环。正是这个区域从活性中心向外折叠，形成配体相互作用位点的很大一部分。这些酶中催化相关的残基位于各自N-和C-末端结构域的所谓α-3螺旋的连续环中(一个组氨酸和两个半胱氨酸)。

硫解酶所接受的反应的一般生物合成机理由其中产生共价酰基半胱氨酸(Cys(Ac))中间体的两个连续步骤组成(方案1)。因此，在第一步中，将酰基(如果底物1是乙酰-CoA的话为乙酰基)转移至催化性半胱氨酸(受体)。在第二步中，在该催化性半胱氨酸与新的底物2之间发生克莱森缩合步骤以获得在2位乙酰化的该底物2。

(i)酰基转移

(ii)克莱森缩合

方案1.-通过硫解酶催化的反应的机理。

硫解酶的活性中心由两个含氧阴离子(oxyanion)孔(I和II)形成，其中产生的负电荷在整个催化循环过程中是稳定化的。

与直链产物相比，支链产物作为用于获得工业上令人关注的新化合物家族的基础。特别地，与直链对应物相比，支链产物表现出作为生物燃料的优点。然而，大多数硫解酶不能合成支链产物。

因此，有必要提供能够合成支链产物以产生工业上令人关注的衍生物的硫解酶。

发明简述

第一方面，本发明涉及突变硫解酶，其能够催化通过式(II)化合物与式(III)化合物的缩合形成式(I)化合物，

其中R₁和R₂独立地选自直链或支链C₁-C₆烷基、直链或支链C₂-C₆烯基、直链或支链C₂-C₆炔基、芳基、芳基-烷基和苄基，并且S-CoA是辅酶A，